1、白血病干细胞的生物学特性白血病干细胞研究进展急性髓系白血病干细胞的研究进展摘要: 白血病干细胞（leukemia stem cells, LSC）是第一个被确认的肿瘤干细胞, 在白血病的形成与病情的发展中具有重要的作用。深入研究其生物学特性将会为白血病的发病机制及其干细胞靶向治疗奠定理论基础。我国白血病发病率约为 2.76/10 万。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病居第六位（男）和第八位（女） ；我国 AL 比 CL 多见（约 5.5:1）,其中 AML（acute myeloid leukemia）最多（1.62/10 万） 1，该文介绍急性髓系白血病干细胞的来源、免疫表型、自我更新机制、生
2、存优势及多重耐药、分子调控机制、靶向治疗研究等。关键词：AML，AML-LSC，免疫表型白血病（leukemia ）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织是由处于不同分化等级差别的细胞组成的, 而维持这一体系的是其中极少数具有自我更新和增殖能力的肿瘤干细胞。1997 年, Bonnet 等 2首先在恶性造血系统肿瘤中证实了肿瘤干细胞, 即白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)的存在, 提出 LSC 是形成白血病的元凶 。那么, LSC有哪些独特的生物学特性， 与正常
3、的造血干细胞相比有哪些异同之处？ 从而导致 LSC 不仅是白血病发生、发展的根源, 而且还是影响疾病预后的重要因素。1AML-LSC 的来源由于 HSC 和 LSC 的表型和功能高度相似，人们从正常造血系统分化等级模式中推测 LSC 可能从正常 HSC 恶性转化而成 2。Bonnet 2等从急性髓细胞白血病(AML)患者中首次分离出 CD34+、CD38-表型的白血病细胞亚群，将之移植给非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，发现此群细胞表现出干细胞样强大的自我更新、分化和无限增殖能力，能启动除急性早幼粒细胞白血病(M3) 外各型 AML 的形成，并在二次移植受体鼠体内观察到同
4、样的结果。他们认为人类 AML 起源于原始造血细胞的一个异质群体，即积累突变的HSC。他们研究发现能将白血病移植给 NODSCID 小鼠的均为CD34+、CD38- 的白血病细胞，而 CD34+、CD38+白血病细胞不能移植 AML至 NODSCID 小鼠，提示大多数 AML 转变的靶点是 HSC。2AML-LSC 的免疫表型免疫表型是细胞功能和身份的标志。LSC 具有干细胞的特性, 也具有与正常造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)相似的免疫表型。研究发现急性髓系白血病(AML) 骨髓细胞中存在 LSC 亚群, 它们能够使 NOD/SCID 小鼠致瘤。除M3
5、型外 , AML 各个型别(M0M5 型)来源的 LSC 均表达相同的免疫表型 CD34+CD38-, 这与正常骨髓 HSC 的表面特征相似。 CD34+CD38-是人们首次认识到的 LSC 表型, 也是目前确认 LSC 的公认标准。此外,LSC 还可表达与 HSC 共同的表型 CD71-、HLA-DR- 。与 HSC 表型特征不同的是, LSC 特异性表达 CD90 -CD117 -CD123+ 3。CDl23 是人白细胞介素 3 受体 a 链(IL-3Ra)，只表达于 LSC 表面，而 HSC 几乎不表达，被认为是 CD34+CD38-的 AML-LSC 的独特标记。 90%的 M3 有
6、t（15,17） （q22；q21） ，该易位使 15 号染色体上 PML（早幼粒白血病）与 17 号染色体上 RARa（维 A 酸受体基因）形成PML-RARa 融合基因。这是 M3 发病及用全反式维 A 酸治疗有效的分子基础 1。LSC 表达的特异性抗原还有 CD33、CD96 、CLL-1。Hauswirth 等 4研究表明 CD33 表达于大部分 AML-LSC 表面，而正常 HSC 不表达。Hosen 等 5对 29例 AML 患者的研究发现，CD34+CD38-AML 细胞中 CD96 表达率为(74.025.3)%，而在正常 HSC 中表达率仅为(4.91.6)。进一步将分离得到
7、的 CD96+和 CD96-。细胞分别移植到受照射的 Rag2-/-c -/-新生小鼠中，只有CD96+表型的细胞能移植成功，表明 CD96+AML 细胞具有 LSC 活性，提示CD96+是 AML 干细胞表面特异分子之一。C 型凝集素样分子-1(C-typelectin-like molecule-1， CLL-1)是特异表达于 AML-LSC 表面的抗原，不表达于正常 HSC6。2. LSC 的自我更新机制自我更新又称自我复制, 是指干细胞进行不对称有丝分裂, 正常稳定状态下约半数子细胞仍保持干细胞的全部特性, 它是 LSC 最显著的特征之一。Hope 等 7将带有示踪标记的人 LSC 植
8、入 NOD/SCID 小鼠, 人 LSC 能在全部小鼠骨髓内形成白血病细胞克隆, 继续取小鼠骨髓细胞进行连续传代移植, 移植 12 周后在第二代、甚至第三代受体骨髓内仍可见与原代相似的白血病克隆, 说明LSC 具有自我更新能力。那么维持 LSC 自我更新能力的分子机制是怎样的呢? 近年来研究证明 Bmi-1 基因和 MLL 基因在其中扮演着非常重要的角色。2.1 Bmi-1 基 因 Bmi-1 是 B 细 胞 特 性 的 Moloney 小鼠白血病病毒整合位点 1 基因的简称 ,为 PcG(polycomb group)转录抑制因子家族的一员,常高表达于造血前体细胞, 是维持 HSC 自我更新
9、的必需因子。而 Bmi-1 等位基因剔除(Bmi- /-)小鼠的长期造血重建能力显著下降, 说明在维持正常造血中起着重要作用。为探讨 Bmi-1 是否同样参与调控 LSC 的自我更新, Lessard 等5将致癌基因 Hoxa9 和 Meis1 导入 Bmi-1- /-小鼠胎肝细胞, 并移植到亚致死剂量照射的同系小鼠, 结果无论受体小鼠 Bmi- 1 基因的表达状态如何(Bmi-1 +/+或 Bmi-1- /-), 在相同的时间内所有受体小鼠均能形成 AML, 并具有相似的表型和病理特征, 但 Bmi-1- /-受体小鼠外周血白血病细胞较低, 其骨髓细胞不能使下一代受体小鼠发生白血病。若诱导
10、Bmi-1 基因表达则能逆转 Bmi-1- /-小鼠来源 LSC 的致病能力。提示 Bmi-1 基因在白血病形成早期并不是必需因素, 但 Bmi-1 高表达却是维持 LSC 自我更新机制的关键。2.2 MLL 基 因 MLL 基 因 即 混 合 系 白 血 病(mixed lineage leukemia)基因, 其编码的 MLL 蛋白是维持正常造血所必需的转录调控因子。最近发现, MLL 相关融合基因在造血祖细胞重获自我更新潜能、并向白血病干细胞转化的过程中起着重要作用。Krivtsov 等6利用鼠干细胞病毒载体将 MLL-AF9 融合基因导入小鼠粒单祖细胞(GMP),这种 GMP 能够启动
11、小鼠发生白血病, 提示 MLL-AF9 通过诱导 GMP 重获自我更新能力从而引发白血病。进一步利用基因芯片分析 MLL-AF9 易位对 GMP 细胞基因表达的影响, 发现 MLL-AF9 融合基因的表达将引起与自我更新相关的基因在 GMP 重新激活, 如 HOXA 和 Mef2c 基因的快速高表达。以上结果表明, MLL-AF9 融合基因的形成参与调控造血祖细胞向 LSC 的转化, MLL- AF9 能够诱导造血祖细胞重新获得自我更新能力。3. LSC 的生存优势LSC 具有独特的生存优势。与 HSC 相似,95%以上的 LSC 处于细胞周期的静止期(G0 期), 因此大多数 LSC 处于休
12、眠状态, 并不进行 DNA 的复制和完成细胞增殖活动。然而, 与 HSC 不同的是, LSC 具有更强的增殖潜能以维持 LSC 的生存优势。根据对 Hoechst 33342 或 Pyronin Y 拒染的特点分离静止期的 LSC, 将其在无外来生长因子的条件下进行无血清培养 72 小时, 结果发现处于 G0 期的 LSC 百分比大大减少(减少到约 16.7%),而大部分 LSC 进入 G1 或 S 期; 然而 , 在相同的培养条件下仍有高达 98.3%的正常 HSC 处于 G0 期, 提示 LSC 能够自发地进入细胞周期, 通过细胞无限增殖以保持 LSC 的生存优势。Guan 等认为这其中可
13、能有两方面因素的参与 , 一方面 LSC 可自分泌 GM- SCF 等生长因子, 从而动员 G0 期的 LSC 进入细胞增殖周期; 另一方面, LSC 中某些基因突变导致非生长因子依赖性的信号转导通路激活, 如酪氨酸激酶受体 FLT3 基因突变形成串联重复序列(ITD), 持续激活的 FLT3/ITD 可通过下游信号通路(STAT5) 传送增殖信号以刺激细胞生存7。与处于增殖期的CD34+白 血病细胞相比,静止期 CD34+白血病细胞表达高水平的抗凋亡蛋白BCL-2 和 BCL- XL,从而赋予 LSC 更强的抗凋亡能力。4. LSC 的多重耐药特点体外实验发现, LSC 对多种化疗药物耐受或
14、呈低反应性 , 一方面与 LSC 自身的细胞周期特点有关, 大多数 LSC 处于静止期 , 因此对临床上的细胞周期依赖性化疗药物( 如 5- 氟尿嘧啶) 不敏感,并对 IL- 3 等细胞生长因子的刺激应答性也较弱。另一方面, LSC 表面表达多种膜转运蛋白 , 能够将 Hoechst 33342 等荧光染料以及多种化疗药物排出细胞外,其中 ATP 结合盒(ATP-binding cassette, ABC)膜转运蛋白发挥了重要的药物外排作用。ABC 膜转运蛋白超家族具有 ATP 依赖性药物排出功能, 主要包括乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白及多重药物抵抗蛋白(MRP)。BCRP 介导的耐
15、药谱主要包括米托蒽醌、阿霉素等抗肿瘤药物。研究发现, 无论是 BCRP 的蛋白质含量和 mRNA 水平, BCRP 均优先表达于 CD34+CD38-白血病干细胞亚群, 使得 LSC 胞内米托蒽醌的药物浓度明显低于 CD34+CD38+细胞。然而, 抑制 BCRP 并不能完全逆转 LSC 对米托蒽醌的耐药, 利用 BCRP 抑制剂 KO143 逆转 BCRP 介导的 LSC 外排作用, 能使胞内米托蒽醌浓度有所增加, 但胞内药物浓度却远远低于仅表达 BCRP 的对照组乳腺癌 MCF- 7 细胞株。这些研究结果提示, LSC 的耐药性与胞膜上 BCRP 高表达有关 , 但同时也不排除其他耐药蛋白
16、质的存在10。最近在多种血液肿瘤 CD34+细胞中发现有 P- 糖蛋白、MRP 和肺耐药蛋白(LRP)等耐药相关蛋白质不同程度的表达。与正常骨髓 CD34+细胞相似, AML 和高危性 MDS 来源的 CD34+细胞表达一定水平的 MRP 和 LRP, 而 P-糖蛋白则在 AML 的表达高于高危性 MDS。因此,LSC 多重耐药性是多因素共同作用的结果, 既与多数 LSC 处于静止期有关 , 也离不开白血病细胞表面多种耐药相关蛋白质的外排作用。3 LSCs 分子调控机制LSCs 的自我更新、多向分化和无限增殖能力，称之为 LSCs 的干细胞性(Stemness)。 LSCs 的干细胞性相关的信
17、号通路由一套关键的基因调控 p。31 核因子(NF)一 rBNFxB 是具有抗凋亡活性的转录因子，在大多数造血系肿瘤和其他肿瘤组成性激活 19】 。利用流式细胞术分选出CD34+CD38。CDl23+表型的 AML 干细胞，以电泳迁移率法 (EMSA)32P 标记检测 LSCs 和正常 CD34+HSC 的核提取物中 NFKB 寡核苷酸序列，发现AML 的 LSCs 中存在 NF-xB 的组成性激活，而在正常 HSC 中未见表达。32 P13KAkt 信号通路P13KAkt 信号通路对细胞生长、生存和凋亡等许多方面都非常关键。P13KAkt 信号通路在 AML 细胞被持续激活3I ，在移植了
18、LSCs 的NOD SCID 鼠中也上调，具有抗凋亡作用，对 LSC 的存活起了重要作用。Pten(Phosphatase and tensin homologue)是一种负性调节 P13K 通路的脂质磷酸酶，对维持正常造血至关重要4f。Yilmaz 等 纠把 Pten 缺失的骨髓细胞或纯化的 HSC 注射到经照射的小鼠，能成功移植并能产生各种谱系的血细胞，但是仅在注射 HSC 初期观察到这种情况。说明 Pten 缺失对 HSC 分化、生存无明显影响，而对维持其静止状态和自我更新至关重要【IS-16。而 LSC 的 Pten 缺失后，导致 LSCs 的产生并增殖。 Pten 缺失在正常 HSC
19、 和 LSCs 中的相反效果为选择性杀伤 LSCs 提供了可能性。 mTOR(Mammalian target of rapamyein)是PL3 K 通路下游调节因子之一，通过底物 p70S6 激酶和 4EBP1 的磷酸化调控蛋白转运。Yilmaz叫用 mTOR 抑制剂 Rapamycin 处理 Pten 缺陷小鼠，发现Rapamycin 不仅消除了 LSCs，使小鼠维持健康，而且挽救了 Pten 缺陷导致的HSC 衰竭。说明 roTOR 活性增高介导 LSCs 增殖和正常 HSC 的衰竭。36 LSCs 壁龛(Leukemia stem cell niche)HSC 和其特异性微环境( 干
20、细胞壁龛)的相互作用是维持 HSC 自我更新和分化能力的关键调控机制。干细胞 niche 有重要的功能，如提供增殖和抑制信号从而维持干细胞的静止性。当 niche 内缺乏膜结合型 Kit 配体时，HSC 不能维持。基质金属蛋白酶9(MMP-9)可使膜结合型 Kit 配体切割为可溶性 Kit 配体，促使 HSC 从静止的位于骨内膜的 niche 内迁移到利于分化的、富含血管的 niche内，以及促使 HSC 迁移到外周血。研究发现 MMP-9 表达水平在 AML 升高。和 HSC 相比，LSCs 可能拥有更多激活的迁移机制，有可能是 MMP 增加了可溶性配体的浓度，使得白血病在 niche 外自
21、我更新或扩增。因此靶向抑制 MMP可能抑制 LSCs 的扩增、提高白血病治疗 。4 基于 LSCs 的靶向治疗研究LSCs 是白血病发生、难治和复发的根源，只有清除 LSCs 才有可能根治白血病。基于 LSCs 的靶向治疗，是未来白血病治疗的方向。41 抗 CDl23 的靶向治疗CDl23 是 CD34+CD38AMLLsCs 的独特标记，仅表达于 LSCs，不表达于正常 HSC。特异性作用于 CDl23 的制剂，既可杀灭 LSCs 又不影响HSC。 Lock 等引利用 NODSCID 小鼠模型研究证明 CDl23 的抗体 7G3 能抑制 AMLLSCs 在骨髓微环境中归巢、定位和增殖，防止器
22、官浸润。42 针对特异性分子通路的靶向治疗421 抑制 NF-kB 信号通路：蛋白酶体抑制剂MGl32、Parthenolide 和 TDZD-8 等，均能抑制 NF-kB 的活性，选择性靶向作用于 LSCs【l 9|。Guzman 等旧“研究发现 MGl32 通过抑制 NF-kB 激活和活化特异性 P53 调节基因选择性地诱导 AMLLSCs 凋亡，而 HSC 几乎不受影响。联合应用 MGl32 和表阿霉素，可见 AML 细胞伴随 p53 调控基因Bax、GADD45 及 p21 讹眦坤上调。MGl32 和表阿霉素预处理 AML 细胞(共 4例样本)12 h 后，将 AML 细胞植入 NOD
23、SCID 小鼠，只有 2 例移植成功，移植率明显降低(39-7 5)。如果预处理 AML 细胞 18 h 再移植，移植率进一步降低为 0128。而经 MGl32IDR 联合处理的正常细胞移植不受影响。Parthenolide(PTL)是菊科植物的主要成分，被证实为 NF-kB 的强抑制剂，可显著诱导人类 AML 和急变期 CML 细胞凋亡，而对正常 HSC 无影响。其分子机制可能为抑制 NFr：B 激活、活化 p53 以及增加活性氧体系(ROS)21。但盯 L 的缺点是水溶性很差，药理学特性较低，限制了它的临床应用。 Jordan等联合 Kentucky 大学的 Crooks 博士一起开发的
24、PIL 类似物DMATP(Dimethylaminoparthen01ide) 是一种口服制剂，它的水溶性比 PTL 大1 000 倍，口服生物利用度达 70，在 NODSCID 小鼠移植模型和犬急性白血病模型中观察到良好的生物学活性。将 DMATP 与 CD34+CD38-CDl23+AML干祖细胞、CD34+CD38-CML 干祖细胞、CD34+CDIO-B-ALL 干祖细胞体外培养，它可选择性杀灭髓系和淋巴系来源的 LSC。DMATP 处理的 AML 细胞，其体外克隆形成能力明显下降，并且 DMATP 可明显降低 AML 细胞移植到 NODSCID 小鼠的能力。DMATP 有望作为靶向作
25、用 LSC 的新型药物19,22。TZD-8 复合物是糖原合成酶 GSK-313(Glycogensynthase kinase-3 beta)的抑制剂，对髓系 LSCs 具有细胞毒作用，而对正常造血干细胞无影响。TDZD8通过引发膜完整性丢失、诱导氧化应激和抑制相关信号通路来介导细胞死亡【231。422 作用于 P13KAktmTOR 信号通路：敲除 Pten 基因的小鼠会导致HSC 过度增殖，HSC 迁移到外周廊和脾脏的数量增加，导致骨髓增殖性疾病和白血病形成，用 mTOR 抑制剂 rapamycin 处理可以恢复 HSC 的正常发展，阻断突变小鼠白血病的形成4| 。但在白血病形成前后使用
26、 rapamycin 的效果不同。Yilmaz 等列用 rapamycin 预先处理 Pten 缺陷小鼠 6 周，再将 AML 细胞移植到受照射的鼠体内，结果发现小鼠维持健康，未表现出白血病的迹象，而未经 rapamyein 处理的对照组鼠在移植后 20 到 3l 天内全部死亡。43 干扰微环境阻断 LSC 和骨髓微环境相互作用CIM4 是一个跨膜糖蛋白，参与细胞的黏附和运输。对人 AML 和鼠 CML模型研究发现，用单克隆抗体靶向 CD44 能抑制 AMI 、CMI 。进展，诱导分化，干扰 LSC 和骨髓 niche 的相互作用。AML-LSC 与 CD44 的单克隆抗体 H90共培养后，L
27、SC 丧失在 NODSCID 小鼠增殖的能力。如果将 H90 加入NOD SCID 白血病模型，可以使植入的白血病负荷明显减少，在体内选择性的杀灭 LSCs1。此外，白血病细胞上的受体 CXCR4 和骨髓微环境中的基质细胞衍生因子 1(Stromal cell-derived factor-l，SDF1)相瓦作用对白血病细胞体外生长和归巢是必需的，CXCR4 成为 AML 的预后指标之一，干扰 CXCR4 和SDF1 的相互作用也是靶向治疗 LSC 的手段。5. 结语LSC 是表型为 CD34+CD38-的白血病细胞亚群, 除具有与自我更新能力和无限增殖潜能等干细胞特性外, 还具有独特的生存优
28、势和多重耐药机制。对于 LSC 生物学特性的深入研究, 将为 LSC 的分离纯化、靶向 LSC 的治疗研究奠定理论基础, 同时也为白血病发病的分子机制研究、疾病监控以及预后判断提供理论依据。参考文献1陆再英 钟南山 . 内科学. 第七版. 北京：人民卫生出版社，20082 Bonnet D, DickJ E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell J. Nat Med, 1997, 3(7):730 -737.3 T
29、aussig DC et al. Blood, 2005, 106(13): 4086- 40924 Hauswirth AW et a1 Ear J Clin lnvestigat，2007，37(1) ：73-82 5 Hosen N，Park CYTatsumi N，et a1 C1396 is a 1eukemic stem cellspecific marker in human acute myeloid leukemiaProc Natl Acad Scj USA，2007，104(26)：11008-110136 Van Rhenen A et a1 Blood2007110：2659-26667 Hope KJ et al. Nat Immunol, 2004, 5(7): 738- 743
