1、第十一章 细胞增殖及其调控教学目的：1 掌握细胞增殖的方式及特点2 了解细胞周期调控的机理教学重点：1 有丝分裂、减数分裂2 各种调控因子的作用教学难点：细胞周期调控的机理讲授与讨论第一节 细胞周期与细胞分裂一、细胞周期（Cell cycle）（一） 概述细胞周期亦称有丝分裂周期（mitosis cycle），细胞生长到一定程度，不是繁殖就是死亡。细胞分裂后产生的新细胞生长增大，随后又平均地分裂成两个和原来母细胞“一样”的子细胞，细胞这种生长与分裂的循环称细胞周期。1 细胞周期的概念 具体地说，细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。又叫细胞的一个生活周期，是一个
2、细胞物质积累与细胞分裂的循环过程。一个周期所占用的时间，即为细胞的一个世代（generation time）。2 细胞周期的划分最早划分细胞周期的是 Howard Pelc （19511953），从细胞形态的变化考虑，将细胞周期划分为间期（interphase）和分裂期（mitosis phase 或 division phase），间期是物质准备和积累阶段，分裂期则是细胞增殖的实施过程。间期难以靠形态学指标划分，Howard 发现 DNA 是在间期的一定时间合成的，于是，他将间期划分为 DNA 合成前期（G1），DNA 合成期（S）和DNA 合成后期（G2）。M 期依形态学指标分为前、中、后
3、、未四个时期，各个时期又称为时相。整个周期表示为：G1SG2M。从细胞增殖的角度来看，G1 期细胞可分为 3 类：1 增殖细胞（周期中细胞、连续分裂的细胞） 有些细胞（少数），可以离开变动期进入固定期，然后进入 S 期，重新开始分裂增殖，它们是能继续增殖的细胞。在一群细胞中，只有一小部分细胞进入 M 期。进入M 期细胞所占该群细胞的百分数，称有丝分裂指数（mitotic index）。2 休止细胞（静止期细胞） 有些细胞通常情况下不能合成 DNA，处于静止状态可达数月甚至更久，但当给予某种刺激时，可重新进入细胞周期，可见这些细胞是暂时不继续增殖，但具潜在增殖能力。1963 年，Lajtha 将
4、这些休止细胞叫 Go 期细胞，指一种暂不增殖而又保持着分裂潜力的，在一定条件下可恢复增殖能力的细胞。认为它们是暂时退出细胞周期的细胞。如肝、肾细胞、淋巴细胞（Go 期）经 PHA 刺激淋巴母细胞进入分裂周期。3 丢失细胞（loss cell） 终端分化细胞或不育细胞、不分裂细胞。这部分细胞终生处于 G1 期，通过分化、衰老至死亡。如角质细胞、神经细胞、肌细胞、红血细胞等。 （二）细胞周期各时相的主要事件1 G1 期 此期可再细分为变动期和固定期。所有通过 M 期的细胞都要进入 G1 期的变动期，以后便走向不同的命运。处在 G1 期的细胞，除丢失细胞外，不管是增殖细胞，还是 Go 期细胞，当它们
5、待要进入细胞周期时，首先进行旺盛的物质合成，为进入 S 期作各种准备。2 S 期S 期长短差异，是与复制单位多少决定的。S 期的活动，是由于细胞内产生了一种蛋白质性质的 DNA 合成诱导者。有人将 S 期细胞与 G1 期细胞融合后培养，可引起 G1 期细胞核 DNA 复制提前。3 G2 期 继续为进入 M 期创造物质条件细胞能否顺利通过 G2 期进入 M 期，受到 G2 期检验点的控制，这一调控点有人称作 R2。有人设想，可能与 cAMP 有关，也有人认为抑素在该期仍有作用。当这种细胞受适宜刺激后，无需 DNA 复制，可直接进入周期。4 M 期（三）细胞周期的研究方法1 细胞周期各时相长短测定
6、（1）标记有丝分裂百分数法（Percentage of labelled mitosis ，PLM法） 此法目的是测定某一细胞群体的细胞周期的总时间 Tc 和各个时相的时长。方法简述：给机体注入 3HTdR，处于 S 期细胞吸收 3HTdR 被标记，随后 G2 期细胞开始出现标记细胞，接着在一短的 tm 时间后，出现的全是标记分裂相，并在 tstm 时间内保持不变，最后标记分裂相聚然消失。依标记分裂指数曲线升降过程，可推求出细胞周期各时相的时长。（2）流式细胞分选仪测定法2 细胞周期同步化法（cell synchrony） 是指将细胞群体阻留在细胞周期同一时相的方法。自然同步（natural
7、synchrony） 在自然界中，有些生物本身有部分地或短时间的细胞分裂同步的现象。人工同步法 指用人为的方法，使培养细胞分裂同步化。（1）诱导同步法（induction synchrony），这一方法是用物理、化学方法处理培养细胞，使之停留在细胞周期的某一时相。a、DNA 合成阻断法（代谢抑制法）：过量 TdR 可将细胞阻止在 G1/S 交界处。b、中期阻断法（分裂抑制法）秋水仙碱M 期缺异亮氨酸G1 期（2）选择同步法（selection synchrony） 用人工方法，从细胞群体中选出某一发育时期的细胞。a、分裂细胞收获法： b、细胞沉降分离法：c、选择性失活法：d、膜淘洗法： 3 细
8、胞融合法 利用不同时相细胞间的融合，可以探讨各时相的生化变化及调控。（四）特异的细胞周期卵裂之特点：1 周期短，几乎只有 S、M。2 卵内物质重新分布而无细胞的生长。3 核质比例越来越大渐近正常细胞。二、细胞分裂（cell division）（一）原核细胞的分裂原核细胞和真核细胞的细胞分裂方式有很大的不同。原核细胞的分裂方式简单，细胞周期短，在适宜条件下可大量繁殖（如细菌每 20 分钟就可分裂一次），其分裂方式为一分二或二分裂，习惯上又称无丝分裂或直接分裂。（二）真核细胞的分裂真核细胞的分裂较原核细胞复杂的多，根据细胞在分裂过程中所表现的形式不同，大体分为三种类型，无丝分裂，有丝分裂和减数分裂
9、。1 无丝分裂（amitosis）又称直接分裂（direct division）因为这种分裂方式是细胞核和细胞质直接分裂。是发现最早的一种细胞分裂方式。早在 1841 年，R.Remak 首先在鸡胚血细胞中观察到这种分裂方式。因为在分裂过程中没有出现纺缍丝和染色体的变化，所以 1882 年，Flemming 提出无丝分裂的概念。2 有丝分裂（mitosis）最初称这种分裂方式为核分裂（karyokinesis），因为在分裂过程中出现纺缍丝和染色体等一系列变化，然后才出现细胞的真正分裂，所以又称为间接分裂（indirect division）或有丝分裂。1882 年 Flemming 提出，还由
10、于这种分裂方式是多细胞生物体的体细胞的分裂方式，故又称体细胞分裂。有丝分裂过程的分析有丝分裂是一连续的复杂动态过程，为叙述方便，根据形态学上的变化，按这些过程的先后顺序分为前期（前中期）、中期、后期和未期。下面以动物细胞的分裂为例，说明各期特点胞质分裂（cytokinesis）除特殊组织细胞外，多数细胞在染色体解旋和核膜形成的同时，便进行细胞体的分裂，或称胞质分裂。但也有胞质分裂与核分裂不同步的。动物细胞的胞质分裂，是以缢缩和起沟的方式进行的，缢缩的动力推测是由于在细胞质周边有一个微丝组成的“收缩环”，它的紧缩使细胞产生缢束，在缢束处起沟，使细胞一分为二。植物细胞的胞质分裂，因带有细胞壁的缘故
11、，另具特点。是靠形成细胞板来完成的。在分裂未期，赤道面处的纺缍丝保留下来，并增加微管数量，向四周扩展，形成桶状结构成膜体（phragmoplast）。来自内质网和高尔基复合体的含有多糖的小泡移向成膜体，小泡膜融合在一起而成为细胞板（cell plate）。一些充满果胶类物质的小泡，继续向细胞板间添充，形成中胶层及初生壁成分。最后细胞板两层膜和亲体细胞的质膜融合，将细胞一分为二。3 减数分裂（meiosis）meiosis 是真核细胞中一种特殊类型的细胞分裂，出现在进行有性生殖的生物的生殖细胞中，是 1883 年 Beneden 最先阐述的，指通过两个细胞周期使染色体数目减少一半的细胞分裂方式。
12、由于发生在生殖细胞成熟过程中，所以又有成熟分裂（maturation division）之称。通过减数分裂使亲代与子代之间的染色体数目保持恒定，保证了物种的相对稳定性；另外在减数分裂过程中，发生非同源染色体的重新组合，以及同源染色体间的部分交换，从而使配子的遗传基础多样化，这就为生物的变异及其对环境条件的适应性提供了重要的物质基础。因此，减数分裂是生物有性生殖的基础，是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。（1）由 mitosisi 向 meiosis 的转变精原细胞和卵原细胞是进行 mitosis 的，为什么到了初级性母细胞就改为减数分裂了呢？是什么因素控制调节这种分裂方式的转变的呢
13、？这些问题尚不清楚，推测可能是多因素的综合作用结果，不过根据有些学者初步实验，可以断定这种转变是发生在前减数分裂的 G2 期。减数分裂前间期的 G2 期。（2）减数分裂过程的分析第一次减数分裂或减数分裂（first meiotic division，meiosis）包括：前期、中期、后期、未期和胞质分裂六个阶段。然后，通过一个短暂的间期进入减数分裂。第二次减数分裂或减数分裂（second meiotic division，meiosis）包括：前期、中期、后期、未期）减数分裂有其鲜明特点，主要表现在前期染色体配对和基因重组。减数分裂与一般有丝分裂雷同。前期根据染色体的形态变化可划分为以下几个时
14、期：细线期偶线期（合线期）粗线期双线期4 Meiosis 的生物学意义及其与 Mitosis 之比较5 影响细胞分裂的因素能够影响细胞分裂的因素很多，而且极为复杂，目前还没达到对其全面认识的水平，下面仅就已取得的资料作一介绍。（1）细胞大小（2）抑素（3）cAMP （4）激素 （5）接触抑制（contact inhibition） 第二节 细胞周期的调控真核细胞周期有两个基本事件：一是 S 期进行染色体复制，二是 M 期将复制的染色体分到两个子细胞中去。在这两个基本事件前，均有一段间隙期，即 G1 期和 G2 期。在这两个间隙期，细胞进行着复杂的决定过程。在 G1 晚期，作为一个新周期的开始点
15、，亦即细胞决定启动新一轮自我复制的位点（Start point 或 restriction Point）受到复杂精细的调控，根据发育需要，或者开始新一轮增殖，或者退出周期分化为特殊功能的细胞或暂时进入 G0 期，决定要进入分化状态或 G0 期的细胞，不能越过“Start”或“restriction”位点。而要增殖的细胞必须有生长因子的作用，命令细胞通过“start”位点，启动新一轮自我复制。因此，细胞周期存在着 G1/S 转换和 G2/M 转换两个重要的控制点。一、MPF 的发现及其作用1 染色体超前凝集实验细胞促分裂因子2 非洲爪蟾卵细胞质注射实验促成熟因子（MPF）1971 年，利用非洲爪
16、蟾卵细胞质注射实验，发现在成熟的卵细胞的细胞质中，必然有一种物质可以诱导卵细胞的成熟。他们把这种活性物质称为卵细胞促成熟因子（maturation promoting factor）或细胞促分裂因子（mitosis-promoting factor）或 M 期促进因子（M phase-promoting factor）,用 MPF 表示。二、p34cdc2 激酶的发现及其与 MPF 的关系裂殖酵母的 cdc2 基因，是第一个被分离出来的 cdc 基因，它的表达产物是一种相对分子量为 34103 的蛋白，被称为 p34cdc2。进一步研究发现，p34cdc2 具有蛋白激酶活性（丝氨酸/苏氨酸蛋白
17、激酶），可以使多种蛋白质底物磷酸化，因而被称为 p34cdc2 激酶。在 G1/S 转换和 G2/M转换两个地方都发挥作用（即阻断细胞周期在晚 G1 期或 G2 期）。芽殖酵母的 cdc28 基因是继 cdc2 基因之后第二个被分离出来的 cdc 基因，它的表达产物也是一种相对分子量为 34103 的蛋白，被称为p34cdc28。它也是一种蛋白激酶，在 G2/M 转换过程中起中心调节作用，同时对 G1/S 转换也是必需的。后来的实验不断证明，p34cdc2 和 MPF 是同源物，都具有蛋白激酶活性并促进 G2/M 转换。三、周期蛋白与此同时，另有科学家以无脊椎动物海胆卵为材料进行细胞周期调控的
18、研究。1983 年报道，通过 35S-Met 标记示踪，在海胆卵中发现两种特殊蛋白质（分子量约 4560KD），其含量随细胞周期进程变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个细胞周期又重复这一消长现象。即在每一轮间期开始合成，G2/M 时达到高峰，M 期结束突然被水解掉，下一轮间期又重新积累合成。把这两种蛋白质命名为细胞周期蛋白（cyclin），简称周期蛋白。揭示 cyclin 是细胞周期调控者，是诱导细胞进入 M 期所必需。进一步的实验又证明，周期蛋白可能参与 MPF 的功能调节。MPF 的生化成分包括两个亚单位，即 Cdc2 蛋白和周期蛋白。当两者结合后，表现出蛋白激酶
19、活性。Ccd2 为催化亚基，周期蛋白为调节亚基。四、CDK 激酶和 CDK 激酶抑制物1 CDK 激酶在分离的 10 多个 cdc2 相关基因所编码的蛋白质（Cdc2）都含有两个共同特点：一个是它们都含有一段类似的氨基酸序列，另一个是它们都可以与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚基，进而表现出蛋白激酶活性。因而它们被统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase），简称 CDK 激酶。所以后来又将 cdc 基因称为 CDK基因。实际上 CDK 是 cdc2（细胞分裂周期基因）等基因编码的蛋白激酶（P34cdc2 激酶、P34cdc28 激酶等）。2 CDK 激
20、酶抑制物指细胞内存在的一些对 CDK 激酶活性起负性调控的蛋白质（Cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIS）。是能与 CDKS 结合并抑制其活性的一类蛋白质，是 CDKS 的负调控因子，具有确保细胞周期高度时序性的功能，在细胞周期的负调控过程中扮演重要角色。目前已发现多种。细胞周期“驱动器”：指推动细胞周期的进程及各个时相间过渡的一组全酶复合物，包括 CDKS，CDKIS 及 CDKS 的正调控因子周期蛋白（cyclin）。五、细胞周期运转调控在细胞周期中最主要的事件是遗传信息载体 DNA 在“DNA 复制期”进行复制，DNA 复制的起始标志着细胞周期的
21、启动。因此，对 DNA 复制起始的调控是控制细胞周期的重要环节。（一）DNA 复制起始位置的调控DNA 复制的起始位置通常不是随机的，而是从染色体某一特定位点上开始。这个位点被称为 DNA 复制起始点（Origin of DNA RepLication），当前最为流行的观点是，DNA 复制起始点是通过起始蛋白质结合在特定的 DNA 顺式序列上形成的。这一模型在原核生物和动物病毒的 DNA 复制中得到证实，但真核细胞要远比该模型复杂得多。DNA 起始序列（ARS：Autonomously Replication Seguence）；起始蛋白质（ORC：origin Recognition com
22、plex）（二）复制起始位置的选择发生在 G1 期G1 期早期的 CHO 细胞核放入爪蟾卵抽提物中进行体外复制，DNA 复制起始位置是随机的；G1 期中晚期的 CHO 细胞核放入瓜蟾卵抽提物中复制，其起始位置就与细胞自身体内复制起始位置一致，不再是随机的了。这表明在真核生物细胞周期的 G1 期中存在一个 DNA 定点复制的调控点，这个点被称为“DNA 复制起始位置决定点（Origin Decision Point，ODP）。这是继 70 年代中期发现的第一个哺乳动物细胞周期调控点（限制点，Restriction Point）以来第二个被发现的细胞周期调控点，它把细胞周期调控与 DNA 复制的起始控制联系了起来。
