1、1第二节 固定化酶的制备和应用1掌握制备固定化酶的常用方法。(重点)2掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点)固 定 化 酶 技 术1固定化酶固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。2制备固定化酶的方法(1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。(2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。3固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。合作探讨探讨 1：
2、对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？提示：物理吸附法。探讨 2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。探讨 3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。思维升华1制备固定化酶的常用方法可用下图所示：2常用的制备固定化酶的方法2固定化酶方法原理 固定载体 优点物理吸附法离子键作用、物理吸附纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体化学结合法酶和多功能试剂之间形成共价键利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，从而得到三维的交联网架结构包埋法将酶包埋在能固化的
3、载体中酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中，前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型工艺简便且条件温和，在生产上应用广泛，而且稳定性能好1关于固定化酶中酶的说法，正确的是( )A酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应B酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用C酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去D固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点【解析】 固定化酶不能催化一系列酶促反应的进行；固定化酶被固定在不溶于水的载体上，可以反复利用，但是随着利用次数的增加，受到外界因素的影响，其活性会逐渐降低；固定化酶具有高效性和专一性的特
4、点。【答案】 B2下列属于固定化酶应用特点的是( )可以被反复利用 有利于酶与产物分离能自由出入载体 一种固定化酶只催化一种酶促反应 酶多用包埋法固定化A BC D【解析】 酶被固定化后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体。通常情况下固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应。酶分子较小，不适合采用包埋法进行固定。【答案】 C3关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法，错误的是( )A固定化酶生物活性可长久使用B一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高3C一般酶制剂参加反应后不能重复利用D固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量【解析】 固定化酶是将酶固定在
5、不溶于水的载体上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离；同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度。固定化酶虽可以多次利用，但不可长久使用。【答案】 A固 定 化 细 胞 技 术1最广泛的细胞固定化方法凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。2优点(1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。(2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。3缺点
6、(1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。(2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。合作探讨探讨 1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。探讨 2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。探讨 3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了
7、什么？提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。思维升华41制备固定化酵母菌细胞的操作流程准备各种实验药品和器具制备麦芽汁活化酵母菌细胞制备固定化细胞浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤发酵麦芽汁2酵母菌细胞的固定化实验需要注意的事项(1)选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一。(2)酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，防止酵母菌细胞的活化液溢出。(3)固定化酵母菌细胞时，应将海藻酸钠与酵母菌细胞的混合液用注射器缓慢滴加到0.05 mol/L 的氯化钙溶液中，而不是注
8、射，以免影响凝胶珠的形成。(4)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，作为对照。3检测凝胶珠是否制作合格的方法(1)机械法：用镊子夹取一个凝胶珠放在实验桌上，用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功；也可以在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。(2)目测法：合格的凝胶珠应是淡黄色，圆形或椭圆形的。如果颜色过浅呈白色，说明海藻酸钠溶液的浓度过低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果形成的凝胶珠形状不规则，则说明海藻酸钠的浓度偏高。1固定化细胞常用包埋法固定化，原因是( )A包埋法固定化操作最简便B包埋法对酶活性的影响最小C包埋法固定化具有
9、普遍性D细胞体积大，难以被吸附或结合【解析】 因为细胞体积大，而酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合，但不易从包埋的材料中漏出，所以常用包埋法进行固定。【答案】 D2下图 1 表示制备固定化酵母菌细胞的有关操作，图 2 是利用固定化酵母菌细胞进行酒精发酵的示意图。请回答下列问题： 【导学号：67850044】5图 1 图 2(1)图 1 中 X 溶液为_，其作用是_。(2)图 1 中制备的凝胶珠用_洗涤后才能转移到图 2 装置中。图 2 发酵过程中搅拌的目的是_。(3)在用海藻酸钠包埋酵母菌形成凝胶珠的过程中，加热溶化海藻酸钠时需注意_加热，然后将溶化好的海藻酸钠溶液_后，加入酵母菌充分搅
10、拌混合均匀。(4)研究发现，固定化强度强的酵母颗粒发酵效果好，且稳定性高、使用寿命长。某机构利用上述装置，将 2%、2.5%、3%的海藻酸钠分别用 2%、3%、4%的 X 溶液进行凝胶化处理，所得到的固定化酵母颗粒的强度及在 28 下发酵 48 h 后的酒精产量见表：海藻酸钠/%2 2.5 3 2 2.5 3 2 2.5 3X 溶液 /% 2 2 2 3 3 3 4 4 4固定化强度(g/30 个 )930 950 990 1 030 1 100 1 140 1 170 1 170 1 160酒精量/% 6.7 6.5 6.5 6.7 6.4 6.2 6.7 6.4 6.3可以看出，随着 X
11、溶液浓度的增加，_增加；凝胶固定化效果较好的海藻酸钠与 X 溶液的浓度分别是_、_。【解析】 图 1 所示为制备固定化酵母菌细胞的操作步骤，X 溶液为氯化钙溶液，作用是使海藻酸钠形成凝胶珠。图 2 所示为酒精发酵过程，因酵母菌进行的是无氧呼吸，故搅拌的目的只是增加培养液与酵母菌的接触面积，而不是增加溶氧量；溶化海藻酸钠时需注意用小火或间断加热，然后将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温后，加入酵母菌充分搅拌混合均匀。 由表格分析可知，随着 X 溶液浓度的增加，酵母菌细胞的固定化强度增加，固定化强度和酒精产量都较大的海藻酸钠与 X 溶液的浓度分别是 2%、4%。【答案】 (1)氯化钙溶液 使海藻酸钠形
12、成凝胶珠(2)蒸馏水 使培养液与酵母菌细胞充分接触(3)用小火(或间断) 冷却至室温 (4)固定化强度 2% 4%61下列说法不正确的是( )A固定化酶和固定化细胞的技术方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法B固定化酶更适合采用化学结合法和物理吸附法C由于细胞个大，而酶分子很小，因此细胞多采用物理吸附法固定D反应物是大分子物质应采用固定化酶【解析】 由于细胞个大，酶分子很小，个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。 因此，细胞多采用包埋法固定化，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化。【答案】 C2试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母菌细胞相似( )A
13、B C D【解析】 A、B 选项适合于酶的固定化，C 选项既用于酶固定，也可用于细胞固定。制备固定化酵母菌细胞用的是包埋法，即将酵母菌包埋在海藻酸钠制成的凝胶珠中，所以与 D 选项相似。【答案】 D3下列有关固定化酵母菌细胞制备步骤的叙述，恰当的是( )A应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母菌活化B配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法C向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀D将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液直接注入 0.05 mol/L 的氯化钙溶液中，会观察到溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成【解析】 由于缺水时微生物处于休眠状态，为了加速酵母菌细胞的活
14、化，将干酵母与蒸馏水混合后用玻璃棒充分搅拌，而不应用自来水，因为自来水可能会有杂菌；为避免海藻酸钠发生焦糊，溶化时要小火或间断加热；如果将刚溶化好的海藻酸钠与已活化的酵母菌细胞混合，有可能会杀死酵母菌细胞；将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠的混合液用注射器缓慢滴加到 0.05 mol/L 的氯化钙溶液中，而不是直接注入。【答案】 B4(2016江苏高考)为了探索海藻酸钠固定化对绿球藻生长的影响，以及固定化藻对含 Zn2 污水的净化作用，科研人员用筛选到的一株绿球藻进行实验，流程及结果如下。请回答下列问题：7图 1图 2(1)实验中的海藻酸钠作用是_，CaCl 2的作用是_。(2)为洗去凝胶球上残余的
15、 CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用_洗涤。图 1 中 1.0%海藻酸钠组培养 24 h 后，移动凝胶球，溶液呈绿色，原因是_。(3)为探索固定化藻对含 Zn2 污水的净化作用，应选用浓度为_海藻酸钠制备凝胶球。(4)图 2 中空白凝胶球组 Zn2 浓度下降的原因是_。结合图 1 和图 2 分析，固定化藻的实验组 2448 h 间 Zn2 浓度下降速度较快的主要原因是_；7296 h 间Zn2 浓度下降速度较慢的原因有_。【解析】 (1)绿球藻为单细胞生物，可用包埋法固定化，实验中海藻酸钠的作用是包埋绿球藻。配制好的海藻酸钠溶液需要滴入 CaCl2溶液中，与 CaCl2反应形成凝
16、胶球，刚形成的凝胶球应在 CaCl2溶液中浸泡一段时间，有利于形成稳定的结构。(2)将固定好的凝胶球用绿球藻的培养液(生理盐水)清洗 23 次，能够洗去凝胶球上残余的 CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻的活性。如果包埋绿球藻用的海藻酸钠浓度过低，或形成的凝胶球孔径8过大，在培养过程中会有绿球藻从包埋材料中漏出来，使溶液呈绿色。(3)分析图绿球藻数量变化曲线可知，浓度为 2.0%的海藻酸钠对绿球藻的包埋效果最好，凝胶球中包埋的绿球藻数量最多，故应选用该浓度的海藻酸钠制备凝胶球。(4)由Zn2 浓度变化曲线可知，空白凝胶球组 Zn2 浓度下降的原因是凝胶对 Zn2 有一定的吸附作用。培养初期，绿
17、球藻生长(增殖)速度较快，导致 Zn2 浓度下降速度较快；培养后期，由于绿球藻生长(增殖)速度减慢、溶液中 Zn2 浓度较低等，Zn 2 浓度下降速度较慢。【答案】 (1)包埋绿球藻(包埋剂) 与海藻酸钠反应形成凝胶球(凝固剂) (2)培养液(生理盐水) 海藻酸钠浓度过低(凝胶球孔径过大) (3)2.0% (4)凝胶吸附 Zn2 绿球藻生长(增殖)速度快 绿球藻生长(增殖)速度减慢，溶液中 Zn2 浓度较低课堂小结：网络构建 核心回扣1.固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具酶活性的酶复合物。2.制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。3.固定化细
18、胞是通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性。4.固定化细胞技术能充分利用细胞内的酶，能催化多步的连续反应。学业分层测评(八)(建议用时：45 分钟)学业达标1下列叙述不属于固定化酶特点的是( )A酶固定化后，活性提高B酶对酸、碱、温度敏感，易失活C在溶液中直接使用酶，难以回收，成本高D固定化酶使酶既可催化反应物，又易与产物分离【解析】 固定化酶可提高酶的稳定性，防止酶失活，使酶既可催化反应物，又易与产物分离，催化后的酶易回收，降低生产成本，但并未提高酶的活性。【答案】 A2酶制剂、固定化酶、固定化细胞已经广泛地应用于各个领域，下列有关叙述错误的是( )9A常用的酶制剂有
19、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶B制备固定化酶和固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法等C常用包埋法将脂肪酶和淀粉酶固定D固定化细胞可以催化一系列酶促反应【解析】 常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶；制备固定化酶和固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法等，一般来说酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，细胞多采用包埋法固定；固定化细胞固定的是一系列酶，因此可以催化一系列酶促反应。【答案】 C3细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是( ) 【导学号：67850045】A成本更低、操作更容易、不能连续生产B成本更高、操作更难、不能连续生产C成
20、本更低、操作更容易、能连续生产D成本更低、操作更难、能连续生产【解析】 酶是由细胞合成的，酶分子很小，比较难固定，而细胞相对较大，相对容易固定，而且无需再进行酶的提取，因而固定化细胞制备的成本更低，操作更容易，并且能连续生产。【答案】 C4下列关于固定化细胞技术的说法中，正确的是( )A物理吸附法的优点是操作简单，吸附牢固B包埋法的优点是操作复杂，条件温和，对细胞无毒性C物理吸附法容易对酶活性产生影响D凝胶包埋常用的载体有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等【解析】 物理吸附法的优点是酶活性不受影响，但吸附过程复杂且吸附不牢固；包埋法操作简单，条件温和，对细胞无毒性。【答案】 D5下列关于固定
21、化技术的叙述，不正确的是( )A从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶更容易B固定化细胞比固定化酶对酶活性影响更小C固定化细胞固定的是一种酶D将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细胞【解析】 在应用操作过程中，固定化细胞比固定化酶更容易、更便捷，对酶活性影响更小；固定化细胞固定的是一系列酶，可使发酵过程变成连续反应过程。10【答案】 C6制备好的凝胶珠是否符合应用要求，常用的检测方法有( )挤压法 摔打法 观察法 培养法A BC D【解析】 检测凝胶珠是否合格，经常使用下列检测方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功
22、。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。还可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断。【答案】 D7下列关于制备固定化酵母细胞的操作，正确的是( )A制备好海藻酸钠溶液后，要立即将其与酵母细胞混合以防凝固B制备固定化酵母细胞的过程中可能用到注射器C以恒定的速度把混合液注射到 CaSO4溶液中D凝胶珠在硼酸氯化钙溶液中应浸泡 10 min 左右【解析】 应将制备好的海藻酸钠溶液冷却后，再加入已活化的酵母细胞，否则会因温度过高杀死酵母细胞。应以恒定的速度把混合液滴加到硼酸氯化钙溶液中而不是 CaSO4溶液中。凝胶珠在硼酸氯化钙溶液中应浸泡 30 min 左右。
23、【答案】 B8下列关于固定化细胞的说法错误的是( )A固定化细胞技术是利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间内的技术B固定化酶和固定化细胞的共同点是所固定的酶都可在细胞外起作用C固定化酶和固定化细胞都能反复使用，但酶的活性迅速下降D包埋法常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等【解析】 固定化酶和固定化细胞都能反复使用，但不会出现酶的活性迅速下降的情况。固定化酶是在细胞外发挥作用，固定化细胞中的部分酶在细胞内发挥作用，也有部分酶可在细胞外发挥作用，所以固定化酶和固定化细胞的共同点是所固定的酶都可在细胞外起作用。【答案】 C9下列有关固定化酶技术和固定化细胞技术的叙述正确的是( ) 【导学号：67850046】A固定化酶和固定化细胞的目的是限制酶与反应物接触，控制反应速率B酶更适合包埋法固定化，细胞更适合物理吸附法固定化C加酶洗衣粉是含有固定化酶制剂的洗衣粉
