1、医学分子生物学 染色质免疫沉淀法1姓名学号 2013224010005 2013224010035 2013224010013 2013225010014 2013224010040染色质免疫沉淀法 功能基因组学（Functional genomics）研究内容是人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、陌生生物体的研究和生物信息学的研究等。目前功能基因组学的研究策略包括以下4个方面：1）建立表达图谱 2） 随机突变筛选 3） 定向诱变 4）生物信息学研究.经典的技术在大量未知基因的研究中具有局限性，目前，一些新技术包括生物芯片、基因敲除(knock out)、 转基因（knock
2、 in） 、RNA干扰（RNAi）以及蛋白质组学研究中的各种技术，在功能基因组学研究中发挥越来越重要的作用。本文就近几年来功能基因组学染色质免疫共沉淀技术（ChIP）方法的一些进展作简单介绍。【概念】染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP ）是研究体内 DNA与蛋白质相互作用的重要工具 1。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异 DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码” 假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会
3、以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。【背景】真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是 DNA。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制-“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与
4、修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转医学分子生物学 染色质免疫沉淀法2移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构 2。【原理】染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯
5、化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息 12。【优点】染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，能真实、完整地反映结合在 DNA 序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。ChIP 技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况 2。 ChIP 基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHI
6、P 与基因芯片相结合建立的 CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用。由此可见，随着 CHIP 的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用 3。【不足】ChIP 技术也有一定的局限性：第一，该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。第二，假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰，例如, ChIP 实验抗体品质较差往往容易造成非特异性DNA 沉淀 , 产生高背景和假阳性。 。第三，甲醛固定可能是
7、暂时的，甚至是非医学分子生物学 染色质免疫沉淀法3特异的，可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。第四，难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等 4。ChIP 实验只能鉴定出转录因子在很短时间处于结合态的 DNA 序列。由于受众多因素的干扰, 使得部分蛋白质结合的 DNA 难以被 ChIP 捕获。第五 , 结合位点与功能的不对等性、结合位点与靶基因的对应关系不确定性以及二代测序技术普遍的读段较短等问题都对转录因子结合位点的深入挖掘造成一定影响 5。【应用】该技术主要应用于 5：1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA 损失与凋亡分析【研究进
8、展】ChIP 方法能研究 DNA 甲基化、染色质结构、组蛋白修饰和转录因子的协同结合 5，或者从预测的靶基因中确定直接的靶位点 6。ChIP 技术和其它分子生物学技术结合（例如普通 PCR6-11，实时定量 PCR12，基因克隆，DNA 微阵列或者更直接的高通量测序技术） ，已经被用于确定转录因子和 DNA 的相互作用 13 或转录因子新的基因组靶位点。最初，ChIP 应用于哺乳动物 14、酵母15、果蝇 16染色质的研究上；近年来，应用在相关转录因子和修饰后组蛋白位置等方面的研究方面 16。ChIP 技术还能用于研究蛋白和蛋白之间的相互作用，如通过酵母双杂交和 ChIP 证实了 DELLA
9、蛋白与 PIF3 蛋白之间的相互作用 17。【参考文献】1 Yu Y, Chen Y, Kim B, Wang H, Zhao C, He X, et al. Olig2 targets chromatin remodelers to enhancers to initiate oligodendrocyte differentiation. Cell 2013; 152(1/2): 248-61.2 Hellman L M， Fried M G. Electrophoretic mobility shift assay（EMSA） for detecting protein-nucleic
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