1、流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其发展历史11 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。12 流
2、式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于 1934 年，Moldavan 提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953 年 Crosland-Taylor 根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过 Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg 等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近 20 年来，随着流式细胞
3、仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大 FCM 的应用领域和使用效果。宋平根的流式细胞术的原理和应用是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是 13 年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在
4、分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。2 流式细胞仪的工作原理和技术指标21 流式细胞仪工作原理 除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。流 动 室 和 液 流 系 统流 动 室 由 样 品 管 、 鞘 液 管 和 喷 嘴 等 组 成 ， 常 用 光 学 玻 璃 、 石 英 等 透 明 、 稳 定 的 材 料 制 作 。 设 计 和制 作 均 很
5、 精 细 ， 是 液 流 系 统 的 心 脏 。 样 品 管 贮 放 样 品 ， 单 个 细 胞 悬 液 在 液 流 压 力 作 用 下 从 样 品 管 射 出 ；鞘 液 由 鞘 液 管 从 四 周 流 向 喷 孔 ， 包 围 在 样 品 外 周 后 从 喷 嘴 射 出 。 为 了 保 证 液 流 是 稳 液 ， 一 般 限 制 液 流速 度 10m/s。 由 于 鞘 液 的 作 用 ， 被 检 测 细 胞 被 限 制 在 液 流 的 轴 线 上 。 流 动 室 上 装 有 压 电 晶 体 ， 受 到振 荡 信 号 可 发 生 振 动 。 激 光 源 和 光 学 系 统经 特 异 荧 光 染
6、色 的 细 胞 需 要 合 适 的 光 源 照 射 激 发 才 能 发 出 荧 光 供 收 集 检 测 。 常 用 的 光 源 有 弧 光 灯和 激 光 ； 激 光 器 又 以 氩 离 子 激 光 器 为 普 遍 ， 也 有 配 和 氪 离 子 激 光 器 或 染 料 激 光 器 。 光 源 的 选 择 主 要根 据 被 激 发 物 质 的 激 发 光 谱 而 定 。 汞 灯 是 最 常 用 的 弧 光 灯 ， 其 发 射 光 谱 大 部 分 集 中 于 300 400nm，很 适 合 需 要 用 紫 外 光 激 发 的 场 合 。 氩 离 子 激 光 器 的 发 射 光 谱 中 ， 绿 光
7、514nm 和 蓝 光 488nm 的 谱 线 最强 ， 约 占 总 光 强 的 80%； 氪 离 子 激 光 器 光 谱 多 集 中 在 可 见 光 部 分 ， 以 647nm 较 强 。 免 疫 学 上 使 用 的 一些 荧 光 染 料 激 发 光 波 长 在 550nm 以 上 ， 可 使 用 染 料 激 光 器 。 将 有 机 染 料 做 为 激 光 器 泵 浦 的 一 种 成 份 ，可 使 原 激 光 器 的 光 谱 发 生 改 变 以 适 应 需 要 即 构 成 染 料 激 光 器 。 例 如 用 氩 离 子 激 光 器 的 绿 光 泵 浦 含 有Rhodamine6G 水 溶 液
8、 的 染 料 激 光 器 ,则 可 得 到 550 650nm 连 续 可 调 的 激 光 ， 尤 在 590nm 处 转 换 效 率 最高 ， 约 可 占 到 一 半 。 为 使 细 胞 得 到 均 匀 照 射 ， 并 提 高 分 辨 率 ， 照 射 到 细 胞 上 的 激 光 光 斑 直 径 应 和 细 胞直 径 相 近 。 因 此 需 将 激 光 光 束 经 透 镜 会 聚 。 光 斑 直 径 d 可 由 下 式 确 定 ： d=4 f/ D。 为 激 光 波 长 ；f 为 透 镜 焦 距 ； D 为 激 光 束 直 径 。 色 散 棱 镜 用 来 选 择 激 光 的 波 长 ， 调 整
9、 反 射 镜 的 角 度 使 调 谐 到 所 需 要 的波 长 。 为 了 进 一 步 使 检 测 的 发 射 荧 光 更 强 ， 并 提 高 荧 光 讯 号 的 信 噪 比 ， 在 光 路 中 还 使 用 了 多 种 滤 片 。带 阻 或 带 通 滤 片 是 有 选 择 性 地 使 某 一 滤 长 区 段 的 光 线 滤 除 或 通 过 。 例 如 使 用 525nm 带 通 滤 片 只 允 许FITC（ Fluoresceinisothiocyanate,异 硫 氰 荧 光 素 ） 发 射 的 525nm 绿 光 通 过 。 长 波 通 过 二 向 色 性 反 射镜 只 允 许 某 一 波
10、 长 以 上 的 光 线 通 过 而 将 此 波 长 以 下 的 另 一 特 定 波 长 的 光 线 反 射 。 在 免 疫 分 析 中 常 要 同时 探 测 两 种 以 上 的 波 长 的 荧 光 信 号 ， 就 采 用 二 向 色 性 反 射 镜 ， 或 二 向 色 性 分 光 器 ， 来 有 效 地 将 各 种 荧光 分 开 。 光 电 管 和 检 测 系 统经 荧 光 染 色 的 细 胞 受 合 适 的 光 激 发 后 所 产 生 的 荧 光 是 通 过 光 电 转 换 器 转 变 成 电 信 号 而 进 行 测 量 的 。光 电 倍 增 管 （ PMT） 最 为 常 用 。 PMT
11、的 响 应 时 间 短 ， 仅 为 ns 数 量 级 ； 光 谱 响 应 特 性 好 ， 在200 900nm 的 光 谱 区 ， 光 量 子 产 额 都 比 较 高 。 光 电 倍 增 管 的 增 益 从 10 到 10 可 连 续 调 节 ， 因 此 对弱 光 测 量 十 分 有 利 。 光 电 管 运 行 时 特 别 要 注 意 稳 定 性 问 题 ， 工 作 电 压 要 十 分 稳 定 ， 工 作 电 流 及 功 率 不能 太 大 。 一 般 功 耗 低 于 0.5W； 最 大 阳 极 电 流 在 几 个 毫 安 。 此 外 要 注 意 对 光 电 管 进 行 暗 适 应 处 理 ，
12、并 注意 良 好 的 磁 屏 蔽 。 在 使 用 中 还 要 注 意 安 装 位 置 不 同 的 PMT， 因 为 光 谱 响 应 特 性 不 同 ， 不 宜 互 换 。 也 有用 硅 光 电 二 极 管 的 ， 它 在 强 光 下 稳 定 性 比 PMT 好 。 从 PMT 输 出 的 电 信 号 仍 然 较 弱 ， 需 要 经 过 放 大 后 才 能 输 入 分 析 仪 器 。 流 式 细 胞 计 中 一 般 备 有 两 类放 大 器 。 一 类 是 输 出 信 号 辐 度 与 输 入 信 号 成 线 性 关 系 ， 称 为 线 性 放 大 器 。 线 性 放 大 器 适 用 于 在 较
13、小 范围 内 变 化 的 信 号 以 及 代 表 生 物 学 线 性 过 程 的 信 号 ， 例 DNA 测 量 等 。 另 一 类 是 对 数 放 大 器 ， 输 出 信 号 和输 入 信 号 之 间 成 常 用 对 数 关 系 。 在 免 疫 学 测 量 中 常 使 用 对 数 放 大 器 。 因 为 在 免 疫 分 析 时 常 要 同 时 显 示阴 性 、 阳 性 和 强 阳 性 三 个 亚 群 ， 它 们 的 荧 光 强 度 相 差 1 2 个 数 量 级 ； 而 且 在 多 色 免 疫 荧 光 测 量 中 ，用 对 数 放 大 器 采 集 数 据 易 于 解 释 。 此 外 还 有
14、调 节 便 利 、 细 胞 群 体 分 布 形 状 不 易 受 外 界 工 作 条 件 影 响等 优 点 。 计 算 机 和 分 析 系 统经 放 大 后 的 电 信 号 被 送 往 计 算 机 分 析 器 。 多 道 的 道 数 是 和 电 信 号 的 脉 冲 高 度 相 对 应 的 ， 也 是 和 光信 号 的 强 弱 相 关 的 。 对 应 道 数 年 纵 坐 标 通 常 代 表 发 出 该 信 号 的 细 胞 相 对 数 目 。 多 道 分 析 器 出 来 的 信 号再 经 模 -数 转 换 器 输 往 微 机 处 理 器 编 成 数 据 文 件 ， 或 存 贮 于 计 算 机 的 硬
15、 盘 和 软 盘 上 ， 或 存 于 仪 器 内 以 备调 用 。 计 算 机 的 存 贮 容 量 较 大 ， 可 存 贮 同 一 细 胞 的 6 8 个 参 数 。 存 贮 于 计 算 机 内 的 数 据 可 以 在 实 测后 脱 机 重 现 ， 进 行 数 据 处 理 和 分 析 ， 最 后 给 出 结 果 。 除 上 述 四 个 主 要 部 分 外 ， 还 备 有 电 源 及 压 缩 气 体等 附 加 装 置 。 211 信号的产生、转换和传输 在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激
16、光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物（每种物质携带的标记物不同吗?）通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得
17、到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管（PMT） 。从 PMT 输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如 DNA 测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算
18、机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。参 数 （ 例 如 ： 细 胞 的 大 小 、 形 态 、 质 膜 和 细 胞 内 部 结 构 ） 测 量 原 理流 式 细 胞 仪 可 同 时 进 行 多 参 数 测 量 ， 信 息 主 要 来 自 特 异 性 荧 光 信 号 及 非 荧 光 散 射 信 号 。 测 量 是 在测 量 区 进 行 的 ， 所 谓 测 量 区 就 是 照 射 激 光 束 和 喷 出 喷 孔 的 液 流 束 垂 直 相 交 点 。 液 流 中 央 的 单 个 细 胞 通过 测 量 区 时 ， 受
19、到 激 光 照 射 会 向 立 体 角 为 2 （ 360） 的 整 个 空 间 散 射 光 线 ， 散 射 光 的 波 长 和 入 射光 的 波 长 相 同 。 散 射 光 的 强 度 及 其 空 间 分 布 与 细 胞 的 大 小 、 形 态 、 质 膜 和 细 胞 内 部 结 构 密 切 相 关 ， 因为 这 些 生 物 学 参 数 又 和 细 胞 对 光 线 的 反 射 、 折 射 等 光 学 特 性 有 关 。 未 遭 受 任 何 损 坏 的 细 胞 对 光 线 都 具有 特 征 性 的 散 射 ， 因 此 可 利 用 不 同 的 散 射 光 信 号 对 不 经 染 色 活 细 胞
20、进 行 分 析 和 分 选 。 经 过 固 定 的 和染 色 处 理 的 细 胞 由 于 光 学 性 质 的 改 变 ， 其 散 射 光 信 号 当 然 不 同 于 活 细 胞 。 散 射 光 不 仅 与 作 为 散 射 中 心的 细 胞 的 参 数 相 关 ， 还 跟 散 射 角 、 及 收 集 散 射 光 线 的 立 体 角 等 非 生 物 因 素 有 关 。 在 流 式 细 胞 术 测 量 中 ， 常 用 的 是 两 种 散 射 方 向 的 散 射 光 测 量 ： 前 向 角 （ 即 0 角 ） 散 射 （ FSC） ； 侧 向 散 射 （ SSC） ， 又 称 90 角 散 射 。 这
21、 时 所 说 的 角 度 指 的 是 激 光 束 照 射 方 向 与 收 集 散 射 光 信 号 的 光电 倍 增 管 轴 向 方 向 之 间 大 致 所 成 的 角 度 。 一 般 说 来 ， 前 向 角 散 射 光 的 强 度 与 细 胞 的 大 小 有 关 ， 对 同种 细 胞 群 体 随 着 细 胞 截 面 积 的 增 大 而 增 大 ； 对 球 形 活 细 胞 经 实 验 表 明 在 小 立 体 角 范 围 内 基 本 上 和 截 面积 大 小 成 线 性 关 系 ； 对 于 形 状 复 杂 具 有 取 向 性 的 细 胞 则 可 能 差 异 很 大 ， 尤 其 需 要 注 意 。
22、侧 向 散 射 光的 测 量 主 要 用 来 获 取 有 关 细 胞 内 部 精 细 结 构 的 颗 粒 性 质 的 有 关 信 息 。 侧 向 散 射 光 虽 然 也 与 细 胞 的 形 状和 大 小 有 关 ， 但 它 对 细 胞 膜 、 胞 质 、 核 膜 的 折 射 率 更 为 敏 感 ， 也 能 对 细 胞 质 内 较 大 颗 粒 给 出 灵 敏 反 映 。在 实 际 使 用 中 ， 仪 器 首 先 要 对 光 散 射 信 号 进 行 测 量 。 当 光 散 射 分 析 与 荧 光 探 针 联 合 使 用 时 ， 可 鉴别 出 样 品 中 被 染 色 和 未 被 染 色 细 胞 。
23、光 散 射 测 量 最 有 效 的 用 途 是 从 非 均 一 的 群 体 中 鉴 别 出 某 些 亚 群 。 荧 光 信 号 主 要 包 括 两 部 分 ： 自 发 荧 光 ， 即 不 经 荧 光 染 色 细 胞 内 部 的 荧 光 分 子 经 光 照 射 后 所 发 出的 荧 光 ； 特 征 荧 光 ， 即 由 细 胞 经 染 色 结 合 上 的 荧 光 染 料 受 光 照 而 发 出 的 荧 光 ， 其 荧 光 强 度 较 弱 ， 波长 也 与 照 射 激 光 不 同 。 自 发 荧 光 信 号 为 噪 声 信 号 ， 在 多 数 情 况 下 会 干 扰 对 特 异 荧 光 信 号 的
24、分 辨 和 测 量 。在 免 疫 细 胞 化 学 等 测 量 中 ， 对 于 结 合 水 平 不 高 的 荧 光 抗 体 来 说 ， 如 何 提 高 信 噪 比 是 个 关 键 。 一 般 说 来 ，细 胞 成 分 中 能 够 产 生 的 自 发 荧 光 的 分 子 （ 例 核 黄 素 、 细 胞 色 素 等 ） 的 含 量 越 高 ， 自 发 荧 光 越 强 ； 培 养细 胞 中 死 细 胞 /活 细 胞 比 例 越 高 ， 自 发 荧 光 越 强 ； 细 胞 样 品 中 所 含 亮 细 胞 的 比 例 越 高 ， 自 发 荧 光 越 强 。 减 少 自 发 荧 光 干 扰 、 提 高 信
25、噪 比 的 主 要 措 施 是 ： 尽 量 选 用 较 亮 的 荧 光 染 料 ； 选 用 适 宜 的 激光 和 滤 片 光 学 系 统 ； 采 用 电 子 补 偿 电 路 ， 将 自 发 荧 光 的 本 底 贡 献 予 以 补 偿 。212 流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参
26、数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。213 数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由 X、Y 二方向组成的二维平面图。横座标 X 是所测的荧光或散射光的强度，用“道数” （Channel No ）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标 Y 通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图
27、、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。22 流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分
28、辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV 值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于 2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的 FITC 的最少分子数来表示。目前仪器均可达到 1000 左右。仪器工作时样品浓度一般在 105107 细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为 500010000，分选速度控制在 1000 以下。流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品
29、，鸡血红细胞做为生物学标准样品。3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍目前拥有市场较大份额的公司是美国的 BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter 公司（原名称Coulter）和德国的 Partec 公司。31 BD 公司流式细胞仪介绍 BD 公司生产的流式细胞仪都冠以 FACs（fluorescence activated cell sorter） ，即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的 FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪） 、FACS CAlibur（流式细胞仪）
30、 、FACSA ria（流式细胞分选仪） 、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪） 、LSR II（数字化分析型流式细胞仪） 。FACSCount 为精确计数淋巴细胞 CD3，CD4，CD8 绝对数而设计的。FACSCalibur 是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T 细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测 4 个荧光参数。可识别粘联细胞。BD FACSA ria 流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达 70，000 细胞/s，分析速度达50，000/s。使
31、用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达 15 色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件 BDACDU 装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。FACSV antage SETM 是在 FACSV antage 的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置 FACS Diva 数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于 FACSV antage。BD LSR II 是 LSR 的数字化升级版，其性能介于 FACSV antage SE 和 FA
32、CS Calibur 之间，是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光，四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。32 Beckman-Coulter 公司流式细胞仪介绍 Beckman- Coulter 公司生产的流式细胞仪以 Profile（早期，现已停产）和 EPICS 系列为代表，近年又推出了 Cytomics FC500 系列。EPICS 系列是大型流式细胞仪，目前市场上有 XL、XL-MCL 和 ALTRA 三种型号，其中 ALTRA 具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics
33、 FC500 系列流式细胞仪体积小，可自动进行 5 种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类 HIV 诊断。特别是 FC500MPL 的独特设计可以在同一系统上使用 1275mm 的离心管和 24 或 96 孔的平板。特别适合工作量大的实验室。这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T 细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。33 Partec 公司流式细胞仪介绍 与 BD 和 Becm
34、an-Coutler 公司的产品相比，德国 Partec 公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操作，便于携带，适合植物学研究，适合边远地区和发展中国家。德国 Partec 公司的产品分为三类：CCA 家族、PAS 家族和 CyFlow 家族（Galaxy 为早期产品，已停产） 。CCA 家族包括细胞计数分析仪 CCA 和倍性分析仪 PA-I。它是单或双参数的台式小型机，可以进行一些常规分析，如核 DNA 测定（检测倍性或细胞周期） 、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小，易操作，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素（如 PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光。PAS
35、 家族包括粒子分析系统 PAS、粒子分析系统 III（PAS-III）和倍性分析仪 PA-II。提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪 PA 能够在 2 分钟内自动测量植物的倍性水平，检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为1 条染色体。PA-I 使用 HBO-100 汞灯，属于弧光灯，可产生紫外激发光和蓝光。PA-II 中增加了 488nm 氩离子激光器，能够检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA 等。汞灯发光是电流经过
36、气体时，气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。CyFlow（R）SL 配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如 HIV 扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用 l2 V 直流电，特别适合边远地区和发展中国家。国际上 20 世纪 80 年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith，1983） ，众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测 DNA 含量的方法（Michaelson，1991） 。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的 DNA 含量（Baird，1994；Jacob，19
37、96；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002） 、检测体细胞杂种（Pfosser，1995；Keller，1996）和游离小孢子培养再生株（Kim，2003）的 DNA 含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几，且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是 Partec 公司的产品，也有少量是 BD 公司生产的流式细胞仪。BD 公司的产品主要定位于医学研究与应用，与 Partec 产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件
38、可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是 BD 公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对利用 BD 流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。如何选择流式细胞仪自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性
39、价比、最适合自己。、DNA 倍体分析DNA 分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞 DNA 含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA 含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些 DNA 检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为 PI，DAPI。流式细胞仪要求：488nm 光源，575nm 滤光片。、细胞生
40、存能力实验使用 Heochest 33342 染料与 DNA 特异性结合，后因细胞活力不同，染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。流式细胞仪要求：360nm 光源，455nm 滤光片。、计数外周血中检测网织红细胞使用 TO 染料能够特异性地与 RNA 结合，结合系数高达 3000，故具有很好的性价比。流式细胞仪要求：488nm 光源，525nm 滤光片，液量绝对计数系统。、外周血、骨髓采集物中 CD34 阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定使用标准 ISHAG 方案，需要 DNA 或其他核染料占用 FITC 通道，PE 标记 CD34 抗体，PE-CY5 标记 CD45
41、抗体。流式细胞仪要求：488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片，液量绝对计数系统。、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC 标记人免疫球蛋白抗体、PE 标记粒细胞表面标志物、PE-CY5 标记 HLA 抗体。流式细胞仪要求：488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。、血小板自身抗体检测血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板
42、减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC 标记抗人免疫球蛋白抗体、PE 标记识别血小板抗体。流式细胞仪要求：488nm 光源，525nm、575nm 滤光片。、移植交叉配型原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测 T 或 B 细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为 HLA 配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE 标记识别 T 细胞 CD3 或 B 细胞 CD29 抗体。仪器要求：488nm 光源，525nm、575nm 滤光片。、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺
43、激后活化效应淋巴细胞早期活化指标 CD69 可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC 标记的 CD3 抗体、PE 标记的 CD8 抗体、PE-CY5 标记的 CD69 抗体。流式细胞仪要求：488nm 光源，525nm、575nm、575nm 滤光片。、检测细胞内因子（TH1/TH2 细胞检测）未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为 PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下，活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细
44、胞外则检测不到，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为 Brefedlin A 或 Monensin。Th1/Th2 细胞首先是 CD4+T 细胞，因此存在着用 CD4 来设定细胞群的问题。我们知道 CD4 不但在 T 细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用 CD4 设门无法将 CD4+T 细胞区分开来。那么我们用 CD3 和 CD4 双参数设门是否可以呢？回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下 CD4 抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于设门。用 CD3 和 CD8 设门，因 CD8 不受佛波脂的影响且绝大多数 CD3+CD8-的细胞都是 CD3+CD4+
45、细胞，因此可用 CD3+CD8-细胞群来确定 CD4+T 细胞群。FITC 标记 CD8，PE 标记 IL-4 和，PE-CY5 标记 IFN-r，APC 或PE-CY7 标记 CD3。流式细胞仪要求：488nm 或 633nm（仅限 APC 染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm 滤光片。、细胞增殖状态检测核增殖抗 PCNA、Ki67、BrdUrd 用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC 标记 PCNA 或 Ki67 或 BrdUrd，PE 或（并）PE-CY5 标记细胞表面标志物。流式细胞仪要求：488
46、nm 或 633nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。、染色体分析流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258 与核苷酸 AT 结合；Chromomycin A3 与 GC 相结合。从而在双参数坐标上根据染色体 ATCG 含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。流式细胞仪要求：360nm 或 488nm 光源，450nm、580nm 滤光片。、BrdUrd 标记追踪细胞分化通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗 BrdUrd 抗体
47、及 PI 核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于 G1、S、G2、M 期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm 滤光片。、淋巴细胞亚群分析外周血 CD3、CD4、CD8、CD19、NK 等各类淋巴细胞亚群定量分析。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm 滤光片，液量绝对计数系统。、白血病免疫分型CD45 设门三色白血病免疫分型。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。、血小板分析血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相
48、应活化指标。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片，液量绝对计数系统。、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。T 系白血病微小残留病灶检测流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片，液量绝对计数系统。B 系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm
49、、575nm、675nm 滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。、细胞凋亡分析DNA 凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI 双染法凋亡检测。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm 滤光片。、肿瘤耐药分析P-gp、LRP、MRP、BCRP 各类耐药蛋白表达及功能检测。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。、强直性脊柱炎诊断检测淋巴细胞 B27 表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。、PNH 诊断外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞 CD55、CD59 表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。流式细胞仪要求： 488nm 光源，525nm、575nm、675nm 滤光片。
