1、药敏试验的意义：1.查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用。 2. 进行 耐药监测 ，为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠依据。 3.利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使用寿命。4. 为新药的研究和评估提供有价值的信息。（二） 、药物敏感试验规则目前世界上通用的规则是德国和欧洲标准，而我国主要以临床试验室标准化委员会（ CLSI ） ，即美国国家实验室标准委员会 (NCCLS) 的规则为标准，这个标准主要包括 CLSI 纸片扩散法（ M2 ）和需氧菌稀释法（ M7 ） 。 （三） 、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 1.标准的正确使用
2、 M100 即新表 M100-S17 ，每年更新 1 次；包括 M2 和 M7 文件， M2 即纸片扩散法 (DD) 文件 M2-A9 ， M7 即 MIC 文件 M7-A7 。 M2 、 M7 文件每 3 年更新一次 ；使用文件时应注意文件是否已更新，避免使用旧文件造成判断结果失误。2.获得文件的方法如果购买厂家的纸片可向厂家索取标准，每年国际化会议也会颁发此文件的中心内容。 （四） 、 CLSIM-100 表内容： CLSIM-100 表主要包括版本中的更新要点、各版本抗菌药物分组、M2 纸片扩散法用的表、 M7 MIC 用的表、 M7 MIC 用的表及词汇表等内容。2007 年主要更新内
3、容 有关“或”的章节 ，即同类抗生素能否相互替代的问题；耐药性的增长及连续发生株的测试原则；不适于尿中分离菌的药物，大环内酯类的说明；革兰阴性菌及阳性菌的更新部分；质量评估和质量控制方面的更新。 （五） 、试验与报告中抗菌药物的选择 M-100 表将抗菌药物分成 A.B.C.U.O 组 1 、 表 1 和表 1A 中所列 A 组药物被认为对特定菌群的常规的首选试验组合以及常规结果报告中应该出现的药物。 2 、 B 组包含一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物，也可以用于首选试验。但是，它们只是被选择性地报告，例如当细菌对 A 组同类药物耐药时，可以选用。其他报告指征可包括以下几点：特定的
4、标本来源 ( 如对脑脊液中的肠道杆菌用三代头孢菌素或者对泌尿道的分离菌株用 TMP/SMZ) ；多种细菌感染；多部位感染；对 A 组药物过敏、耐受或无效的病例；为流行病学调查目的向感染控制组报告。 3 、 C 组包括替代性或补充性抗菌药物，可在以下情况进行试验：某些单位隐匿局部或广泛流行的对数种基本药物耐药的菌株；治疗对基本药物过敏的患者；治疗少见菌的感染 ( 如氯霉素对沙门菌属或某些假单胞菌属 ) ；为流行病学目的向感染控制组报告。4 、 U 组 (“ 泌尿道” ) 列出了某些仅用于治疗泌尿道感染的抗微生物药 ( 如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物 ) 。除泌尿道，其它感染部位分离的病原菌不用此组
5、药物进行试验。 5 、 O 组 (“ 其它” ) 对该组细菌有临床适应症但一般不允许常规试验与报告的药物。 6 、 Inv 组 (“ 研究性” ) 对该菌群作研究用且尚未经 FDA 批准的药物。 （六） 、试验操作的基本原则 1. 临床标本不能直接做药敏试验，目的以准确结果回报临床。 2. 不应在同一平板做混合菌药敏试验。 3. 与感染无关菌株（定植菌）不做药敏试验。 4. 判断标准：一菌一药一规则。二、方法分类简介及标准化操作流程 药敏试验分为以下实验方法：纸片扩散法 、 Etest 法 、琼脂对倍稀释法 、肉汤对倍稀释法 、仪器法。 （一）纸片扩散法 主要介绍内容包括：纸片扩散法的原理、培
6、养基的制备、接种物的制备及接种、贴药敏纸片、孵育与判读。 1 、 KB 法原理 ：将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上。经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，根据判读标准即可判定该细菌对某种药物的敏感程度操作流程图注意事项：1.全程无菌操作 2. 湿度控制3. 胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响4. 培养基用水5. 质控培养基种类 1.Mueller-Hinton 琼脂培养基（非苛氧菌）2. HTM 培养基：其组成成分如下： M-H 琼脂粉； 15 /ml 牛羟基血红素； PH7.2-7.4 ； NCCLS 不推荐用 M-H 巧克力培
7、养基作嗜血杆菌药敏试验。 （嗜血杆菌）3.GC 琼脂 . 此补充品 ( 1 升 水中加入 1.1g L- 胱氨酸， 0.03g 盐酸鸟嘌呤， 3mg 盐酸硫胺， 13mg 对鞍基苯甲酸， 0.01g 维生素 B12 ， 0.1g 辅羧酶， 0.25gNAD ， 1.0g 腺嘌呤，10gL- 谷氨酰胺， 100g 葡萄糖，和 0.2g 硝酸铁 ) 是在 GC 琼脂高压灭菌后加入的 . （淋病奈瑟菌）4. 5 7% 脱纤维羊血的 M-H 琼脂（链球菌） 培养基的制作过程中最重要的是厚度，即厚度 4mm 是最重要的因素。2. 接种物的制备1). 直接菌落悬液法多用，广泛2). 生长法少用，局限性3)
8、. 注意事项： 嗜血杆菌、淋球菌配制菌悬液必须采用巧克力培养基上的菌落作直接悬浮法。菌液浓度应严格要求 0.5 麦氏单位。选取新鲜的纯菌落，配置 0.5 麦氏单位的菌悬液，：接种物浊度调整好后，最好在 15 分钟内接种，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，挤出多余的接种菌液。用棉拭子在无菌的稍干燥的 M-H 琼脂表面划线接种，再重复操作两次，每次将平板转动约 60 度，保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘。在加含药的纸片之前，可以将培养皿盖半开 3-5 分钟，但不超过 15 分钟，促使表面过多的水分被吸收。4 、药物选择注意1.通过 CLSI 推荐表选择药
9、物，标志性药物不可少，如： FOX- STAPH， CN120- ENTEROCOCCI。纸片顺序可做调整，如：测定 E.coli 和 Klebsiella pneumoniae 时 CAZ 、 CTX 纸片贴在含酶抑制剂的纸片如 AMC 旁边，初步提示是否产 ESBLs 。 2.在接种好的琼脂平板上贴加纸片注意要点 将事先确定的抗微生物药组合的纸片分贴到接种好菌的琼脂平板表面。每个纸片应与琼脂表面完全接触，并且应均匀分布，使其中心间距不小于 24mm 贴完纸片后，应在 15 分钟内，将平板反转过来，置于 35 孵箱中。 注意事项： 1.150mm 平板所贴纸片不应超过 12 个， 100mm
10、 的不应超过 5 个，嗜血杆菌要求 150mm 平板贴纸片不应超过 9 张， 100mm 平皿贴纸片不应超过 4 张。 2.纸片一但接触了琼脂表面，就不应再挪动位置。 3. 除嗜血杆菌，淋球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟氏外， 平板不应在 CO 2 含量高的空气中孵育，因为其解释结果是根据普通空气中的孵育结果研究出的，而 CO 2 会显著改变某些药物的抑菌圈大小。5 、判读平板和解释结果 孵育 16-18 小时后，检查每一块平板，如果平板划线满意， 接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融和生长。则可以开始记录抑菌环大小。如果出现明显的单个菌落，说明接种量太少，必须重复试验。注意： 葡萄球菌或肠
11、球菌应在投射光的照射下判读，变形杆菌属会攀延生长，应读大的抑菌环。 下图所示为理想的试验结果。 6 、测量工具 游标卡尺与普通直尺 图中所示为经常用到的测量工具，注意用直尺测量时应通过纸片的中心，同时尽量贴近平皿；游标卡尺只需读到 mm ，测量时也应尽量贴近平皿。 7 、 KB 试验中常见的错误来源 KB 试验中常见的错误来源有抄录数据时的书写错误，测量抑菌圈直径的读数错误，菌株有污染，错误的孵育温度或空气条件， 试验用培养基的质量不合格，尤其厚度，纸片在试验室取用或贮存的过程中失效，接种菌悬液太浓或太淡，判读标准错误。 (二)Etest 试验 1.原理： E 试验 (E test) 是一种定
12、量的抗生素药敏测定技术，此试验是稀释法和扩散法的结合产物，可用于在琼脂培养基上判定某抗生素对微生物的最小抑菌浓度 (MIC) ，用 g ml 表示。 E 试验能用连续的 MIC 数值直接对抗生素的药敏试验结果进行定量。由于 E 试验 MIC 值都来自一个预先制备且连续的抗生素浓度梯度，因此它们与常规的不连续对倍稀释法所获取的 MIC 值更为精确。尽管 E 试验的操作与纸片扩散法相似，但它又不同于常规纸片法。 Etest 试验的要点是纸片扩散和连续浓度梯度的结合，试纸条稳定，结果可靠。 2.步骤同纸片扩散法 包括接种物制备，铺菌，注意事项：长棉棒和双平皿。贴条，孵育，读数。下图所示为 ETest
13、 试验的主要操作步骤：取出待检测的 ETest 试纸条，用两端带有粘性胶贴的工具粘取试纸条，将试纸条边压边贴在已经铺好菌液的平皿表面，或用电子取条笔进行上述操作。在贴条过程中， 90mm 平皿只能贴 2 条，同时不同的试纸条高浓度的一段应该向背；若贴 2 条含有酶抑制剂的试条应将含有酶抑制剂的一端贴在同一侧。 贴条注意事项：试条事先恢复室温： 10 分钟左右。 试条的数量与角度： 4-6 条、 1-2 条。 贴条的时间：平皿多余水分已经消失。 试条的方向：高浓度端向外。 贴条的动作：平稳、流畅、不拖拉。 气泡的处理：尽量向一端赶。 3.孵育同 K-B 法 注意孵育时间、环境温度及酸碱度。 读数
14、原则：杀菌剂读清晰的边缘见图 1 ，抑菌剂读大菌落与小菌落的交界见图 2 。变形杆菌读最小的 MIC 值，后两张为含酶抑制剂抗生素的测试结果。不同菌株的读数技巧略有不同，经验非常重要。 (三) 琼脂对倍稀释法1.原理及步骤（琼脂稀释法）抗生素稀释梯度不同抗菌药物对不同的特定细菌所设置的抗菌药物梯度不同，抗生素浓度梯度应包含临床有价值的稀释浓度其最高浓度应高于血液或局部组织液的峰值，最低浓度应低于对照菌的 MIC 值。 将配置好的不同浓度的抗菌药物按预置比例加入肉汤或已平衡温度（ 45-55 ）琼脂液中，使其成为不同浓度梯度测试系列。 将待测菌配制成 1.210 7 ml 浓度。用多头接种器或加
15、样器在每一浓度梯度的肉汤或琼脂中加入菌悬液使其达最终浓度（肉汤稀释法为 10 5ml ，琼脂稀释法为 104 点。 ）置 35 培养 18-24 小时，观察结果。 2.结果判读 以最低抗菌药物浓度仍能抑制细菌生长为该抗菌药物对特定菌的最低抑菌浓度（ MIC ） 。将最低抑菌浓度和低两个梯度培养液转种到琼脂或血平皿，置 35 培养 18-24 小时，观察有无细菌生长，最低抗菌药物浓度不生长细菌的浓度为最低杀菌浓度（ MBC ） 。将 MIC 值和 “ 解释 ” 标准同时报告给临床医生（如 0.03 /ml ， 敏感 。(四)肉汤（宏量和微量）稀释法NCCLS 推荐用来测定抗菌药物对一特定菌的体外活性的方法。
