1、7,食品安全快速检测技术及应用,项目八 食品中微生物的快速检测,常见的食源性病原体: 沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌( 魏氏梭菌) 、猪囊尾蚴、旋毛虫、黄曲霉等。 常用微生物快速检测方法有即用型纸片法、生物化学技术、选择鉴定用培养基法、分子生物学检测技术、ATP生物荧光技术、LAMP法、免疫分析检测技术、细菌直接计数法、噬菌体鉴定技术、全自动微生物分析系统等。,快速检测菌落总数 一次性菌落总数测试片,我国细菌性食物中毒中，70% 80%是由沙门菌引起的。,在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。 一旦污染，微生物将大量繁殖而
2、引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒。,食品中病原菌的快速检测面临的主要问题,(1)分离、富集待测病原菌； (2)提高检测的速度和准确性，同时检测多目标微生物。,食品微生物快速检测技术的发展趋势,(1)绘制各种菌落图谱，开发在线检测软件，提高检测效率 (2)定量测定微生物细胞特征和性能， (3)克服分子生物学方法的缺点，简化检测程序，使食源性病毒的检测方法向自动化、快速化、灵敏度高、特异性强、重复性好以及简易易行 (4)试验条件标准化及检测的高精度和高灵敏度发展。,微生物学概念,菌落：是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的微生物集合而成。当样品
3、被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落形成单位叫做CFU（Colony-Forming Units）：是形成菌落的菌落个数，不等于细菌个数。两相同细菌靠得很近或贴在一起，那么经过培养这两个细菌将会形成一个菌落，此时就是2个细菌，1CFU。菌落总数往往采用的是平板计数法，经过培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落，于是以CFU/ml或CFU/g报告之。,菌落总数：是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等），每克（每毫升）检样所生长出来菌落的总数
4、。,微生物学概念,用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。,食品菌落总数严重超标，会破坏食品的营养成分，加速食品腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。,食品中菌落总数纸片法,细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。,案例,夏令时节是各类冷饮产品的销售旺季，某市消保委近期对该市流通
5、领域的冰淇淋进行了比较试验。检测显示，22件样品中，有10件不符合标准。其中，冰雪皇后(DQ)、酷圣石、多乐星等多个知名品牌因大肠菌群超标等原因上了“黑榜”。 据专家分析，大肠菌群超标的主要原因是二次污染。如加工器具没有定期清洗消毒，操作人员在上完卫生间后洗手不彻底，个人卫生状况未达标，直接影响最终产品的卫生状况。,检测意义,概念：大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸或醛，并产生-半乳糖苷酶需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 来源：该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 意义：大肠菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒处理、加工后
6、保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。,步骤,大肠菌群测试纸片法,将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。 若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点为大肠菌群阳性纸片。纸片保持紫兰色不变或在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄色均为大肠菌群阴性纸片。,加水的纸片,大肠杆菌,大肠杆菌革兰氏染色,电子显微镜下的出血性大肠杆菌,细菌,大肠菌群检测试剂盒,图1加样后排气泡,图2 大肠菌群阳性（左） 大肠菌群阴性（右
7、）,图3 大肠菌群试管阳性（左） 大肠菌群试剂盒阳性（右）,方法原理：与国标法相同。事先将浓缩乳糖胆盐培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、GN增菌液、7.5%氯化钠培养基、包被在试剂盒中，随时取用,观察结果：样液变为黄色为产酸、集气窗中有气泡为产气，既产酸产气的样品为阳性结果，见图2、图3。根据试剂盒的阳性管数，参照国标GB/T4789.3-2003的方法查MPN检索表报告结果。,操作步骤,1. 样品处理：按食品卫生微生物学检验GB/T4789.3.4.5.10-2003。 2. 加样：将试剂盒放在台面上，打开盒盖，用无菌吸管吸取3个1：10稀释液10mL分别加入试剂盒3个大发酵培养基孔内，用无菌吸
8、管吸取3个1mL分别加入试剂盒3小发酵培养基孔内。另用无菌吸管取1：10稀释后的样品1mL注入到9mL灭菌生理盐水中（1：100）取此管3个1mL稀释液加入到试剂盒另3个小发酵培养基孔内。另用无菌吸管吸取稀释后的样品3个4mL分别加入致病菌增菌管（孔）（A、B、C）孔内。 3. 排气泡: 加样后集气窗内如有气泡存在，可将试剂盒以3045度角倾斜，（图1）必要时可轻轻用力在桌面敲击数下即可排出集气窗内气泡。 4. 培养：将加样后的试剂盒置36 1温箱中，培养1824h。,样品处理,注意事项,1加入样品后不需摇匀，平拿平放。 2 加样时可用一次性无菌塑料吸管，将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处。 3
9、 在培养箱中取试剂盒时应平托出来，不要倾斜以免由于试剂盒的倾斜将阳性管集气窗中的气泡排出而影响结果。 4 试剂盒为一次性无菌用品，供一次性使用。,实验四 食品中菌落总数测试,本章学习要求了解食品安全微生物指标 掌握食品中菌落总数测试的快速检测技术,菌落总数测试片,测试片检测方法有操作简单，检测周期短等优点，它一旦投入使用，将大大缩短检测周期，简化实验操作并取得较大的经济收益，目前已被国内很多食品工厂所认可并使用。位列美国前100强的80多家食品厂，都在使用3M Petrifilm测试片来进行微生物的检测,原理 测试片是美国3M公司发明的一种进行菌落计数的干膜，采用可再生的水合物材质，由上下两层
10、薄膜组成。上层聚丙烯薄膜含有粘合剂、指示剂及冷水可溶性凝胶；下层聚乙烯薄膜含有细菌生长所需的营养琼脂培养基。细菌在测试片上生长时，细胞代谢产物与上层的指示剂TTC发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色非溶解性产物三苯甲，从而使细菌着色。故测试片上红色菌落判断为菌落总数。具体方法详见行业标准SN/T 1897-2007食品中菌落总数的测定Petrifilm测试片法。,测试片法适合于各类食品及食品原料中菌落总数的测定，也可用于检测食品加工容器、操作台和其他设备表面的菌落总数。,使用方法 菌落总数测试片的使用方法如图：,3 操作方法 3.1样品处理。无菌称取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸
11、缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，必要时用1mol/LNaOH或1mol/L HCl溶液调节样品匀液pH至6.67.2。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，做出1:1000等稀释度的样品匀液，每次换一支吸管。3.2接种。一般食品选23个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。将菌落总数测试片置于水平实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右使培养基凝固，每个稀释度接种两
12、片，同时做一片空白阴性对照。3.3培养。将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上，水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。一般食品培养温度为361，培养1524h；水产品培养温度为301，培养48h。 4 结果判读 细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。,7.2磷酸缓冲液稀释液的配制与灭菌 贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121高压灭菌15分钟，或者放入消毒碗柜中消毒。 7.3 生理盐水的配制与灭菌：取8.5g分析纯氯化钠溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，先煮开后进行分装，取9mL加入到10mL洁净试管中，盖上硅橡胶塞或棉纱塞，放入红外线消毒柜中消毒。,THANKS,谢谢聆听,
