1、第六章 电泳技术与仪器,郑 芳,重点提示,电泳技术的基本原理是什么？ 影响电泳的因素有哪些？ 电泳技术按分离的原理可分为哪几类？ 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的原理是什么？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的基本原理是什么？ 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳的基本原理是什么？ 毛细管电泳的基本原理是什么？毛细管电泳仪的基本结构有哪些？ 常用电泳仪的基本结构有哪些？ 电泳技术在临床上可应用于哪些方面？,目 录,第一节 电泳技术的基本原理和分类 第二节 常用电泳分析方法 第三节 电泳仪的基本结构 第四节 电泳技术在临床检验中的应用,发展历程,1809年，俄国科学家列伊斯，发现电泳现象。
2、1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术，证明了血清是由白蛋白、1、2、和蛋白组成，获得1948年诺贝尔化学奖。 1950年后，区带电泳从发展到成熟。 1980年以来，毛细管电泳逐渐受到重视。,第一节 电泳技术的基本原理和分类,电泳（electrophoresis, EP） 带电荷的溶质或颗粒在电场中移动的现象。 电泳技术（electrophoresis technique） 利用电泳现象将多组分物质各组分分离的技术。 电泳仪 采用电泳技术分离多组分物质的仪器。,一、基本原理,电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。
3、,一般来说，不同成分的物质，其颗粒本身所带的电量以及颗粒的半径(或摩擦系数)都是不同的，所以它们的迁移率各不相同。利用这一原理即可把物质中各种不同的成分分离开来。例如，血清蛋白电泳分离含有各种蛋白质(清蛋白、1, 2 ,球蛋白等)，,：介质粘度 r：粒子半径 Q：荷电量,一、基本原理,若溶液里一电量为q的带电粒子，在场强为E的电场中以速度v移动，则它所受到的电场力F1应为：F1 =QE 根据斯托克司定律，在液体中泳动的球状粒子所受到的阻力F2 ，为：F2=6RV 式中为介质的粘度系数，R为粒子半径。当二力平衡，即F1 = F2时，粒子作匀速运动。且有V=QE/6r 从上式可以看出粒子泳动速度不
4、仅与本身性质有关，还受到外界因素的影响,二、影响因素,1. 内在因素：电荷的正负、大小、形状、分子量2. 外界因素：电场强度溶液性质：pH值、离子强度、溶液粘度电渗作用吸附作用焦耳热,电渗作用：,在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动，此种情况称为电渗现象。单位场强下的液体移动速度称为电渗速度。液体的电渗速度与固液两相间的电势成简单的正比关系，所以可以利用电渗来测量电势，但此法只限于能形成毛细管或多孔介质的材料。,三、分类,1.按分离原理分类：区带电泳ZEP、移界电泳MBEP、等速电泳ITP、等电聚焦电泳IEF、免疫电泳IEP。,（1）
5、区带电泳 是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、凝胶电泳等。,（2）移界电泳 移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠，已淘汰。,（
6、3）等速电泳 在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。所得到的区带是相互连接的，且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。,（4）等电聚焦电泳 利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带，分辨率极高。,
7、支持介质电泳 滤纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳,2.按载体分类：自由电泳和支持介质电泳,自由电泳 显微镜电泳 柱电泳 移动界面电泳 等速电泳,三、分类,第二节 常用电泳分析方法,电泳检测的一般步骤,点样 电泳 染色 使用不同的染料或者底物，检测不同类型的蛋白: 血清蛋白、脂蛋白、各种酶类、血红蛋白。 结果分析,一、醋酸纤维素薄膜电泳,醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis） 以醋酸纤维素薄膜为支持介质的电泳。 特点： 染色条带清楚 、快速省时 、灵敏度高，样品用量少 、结果可
8、长期保存、应用广泛 。,醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）： 以琼脂糖为支持介质进行的电泳。 特点： 具有大量微孔，其浓度决定孔径大小；电泳图谱清晰、分辨率高、重复性好；可进行定性或定量检测。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳。 （一）聚丙烯酰胺凝胶特性Acr单体可通过两种催化体系，在加速剂TEMED的作用下发生聚合反应。 凝胶的孔径、浓度与被分离物质分子量之间有密切的关系
9、。PAGE的性能取决于凝胶的总浓度和单体Acr与交联剂Bis之比。,（二）不连续PAGE的分离原理：浓缩效应,（A）样品胶、浓缩胶和分离胶中均有快离子，慢离子放在两个电极槽中，缓冲配对离子存在于整个体系中； （B）电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄区带； （C）蛋白质样品被分离成数个区带。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,缓冲体系的离子成分及pH的不连续性浓缩效应示意图,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,（二）不连续PAGE的分离原理：分子筛效应 相对分子质量或分子大小和形状的物质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应（molecular sieve ef
10、fect）。,（二）不连续PAGE的分离原理：电荷效应,（二）常用的聚丙烯酰胺电泳技术（展） 1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 3. 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 4. 聚丙烯酰胺双向电泳,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,（1）SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。,一、SD
11、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳,二、梯度凝胶电泳-增加分子筛效应 随着泳动距离增加而丙烯酰胺浓度也逐渐增加的梯度聚丙烯酰胺凝胶,目前已广泛用来代替单一浓度的凝胶。浓度梯度胶随浓度增加而孔径逐渐变小,这将对蛋白质组成的分析更为细致,同时能获得更清晰的蛋白质区带。 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。,净电荷与PH的关系曲线,三、等电聚焦电泳电荷效应1等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液（两性载体电解质）中进行分离，每一种被 分离的两性物质都移向与它的等 电点相一致的pH位置，在那里不
12、 再移动（称为聚焦）。,净电荷与PH的关系曲线,等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快;分辨率高;加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,四、双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中 各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋 白质分子量的大小使其在垂直 方向进行分离。其结果不再是 条带状，而
13、是呈现为斑点状。,双向凝胶电泳仪,胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向 等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,双向凝胶电泳示意图,第二节 常用电泳方法,毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE) 以内径20200nm的柔性毛细管柱作为分离通道、以高压直流电场作为驱动力，对各种小分子、大分子或细胞等进行高效分离、检测或微量制备等有关技术的总称。 （一）基本原
14、理 电渗流（ electro-osmotic flow, EOF）； EOF是推动流动相的驱动力，对物质的分离起着重要作用,四、毛细管电泳,四、毛细管电泳,（二）优点 热效应低 高灵敏度、高分辨率 所需样品少、检测速度快 自动化程度高、操作简便、成本低 （三）分类 毛细管区带电泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦 毛细管胶束电泳 毛细管电色谱 毛细管等速电泳,四、毛细管电泳,（一）毛细管区带电泳它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分，在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离。根据组分的迁移时间进行 定性，根据电泳峰的峰面 积或峰高进行定量分析。,毛细血管区带电泳原理图,毛细管
15、电泳的分离模式,（二）毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE) 常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱，依据分离支撑物的分离作用不同，CGE又分为非变性CGE和变性CGE，前者以分子筛、电荷质量比的作用进行分离；后者则以质量、分子筛的作用进行分离。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。,（三）毛细管等电聚焦电泳不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可 以分离等电点差异小于 0.01 pH单位的两种蛋白质，例如 肽类、蛋白质的分离。,毛细管等电聚焦电泳仪,（四）毛细管胶束
16、电动色谱(MECC)MECC系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。,毛细管电泳,毛细管胶束电动色谱原理图,（五）毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充 或在毛细管壁上键合（或涂壁）固定相，从而构成毛细管色谱柱，依靠电渗流推动流动相，携带样品迁移，根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差别而分离。
17、,CEC-加压毛细管电色谱仪,（六）毛细管等速电泳毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。,（七）毛细管电泳芯片毛细管电泳芯片是在常规毛细管电泳的原理和技术基础上，利用微加工技术在平方厘米级大小的芯片上加工出各种微细结构，如通道和其它功能单元，通过不同的通道、反应器、检测单元等的设计和布局，实现样品的进样、反应、分离和检测，是一种多功能化的快速、高效和低耗的微型实验装置。,微流控分析芯片,微流控分析芯片目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大
18、限度地把分析实验室的功能转移到便携的芯片中。 微流控分析芯片通过微机电加工技术把整个实验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在几平方厘米的微流控芯片上，且可多次使用，因而极大地减少了样品和分析试剂的用量，降低了分析的成本，加快了分析的速度，具有广泛的适用性 。,第三节 电泳仪的基本结构,一、常用电泳仪的基本结构,Grassmann-Hanning 型滤纸电泳槽,常用电泳仪的基本结构及技术指标,一、常用电泳设备的基本结构（一）电源（二）电泳槽（三）附加装置,平卧式电泳槽装置示意图,二、毛细管电泳仪的基本结构,毛细管电泳仪示意图,毛细管内径、长度、壁厚度,高压、毛细管柱、检测、
19、进样、冷却系统。,样本架及试管ID号的阅读器,样本稀释杯,稀释针,样本盘,二、毛细管电泳仪的基本结构,光导纤维,Peltier 温控元件,温控装置的分解图,毛细管洗涤系统,二、毛细管电泳仪的基本结构,第四节 电泳技术在临床检验中的应用,电泳技术在临床检验中的应用,一、血清蛋白电泳 二、尿蛋白电泳 三、血红蛋白电泳 四、糖化血红蛋白电泳 五、免疫固定电泳 六、同工酶电泳 七、脑脊液蛋白电泳 八、脂蛋白电泳,急性烧伤病人的电泳图谱,大面积烧伤病人,其图谱显示Alb、1、显著减少而2明显增加.临床上产生低蛋白血症,其原因:一是血清渗出,二是皮肤丢失,急性肝脏疾病,三、血红蛋白电泳,正常血红蛋白电泳曲
20、线,Hb A,Hb A2,Hb A,Hb A2,异常血红蛋白电泳曲线,Hb A,Hb F,Hb Bart,一、血清蛋白电泳,异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征,一、血清蛋白电泳,二、尿蛋白电泳,尿蛋白含量增加,a2-巨球蛋白 (MW :900 kDa),二、尿蛋白电泳,五、免疫固定电泳,正常血清标本,Ig G l单克隆免疫球蛋白(近负极端),六、同工酶电泳,乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase, LDH) 肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK) 碱性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP) 天冬氨酸氨基转移酶(Asparta
21、te transaminase, AST) - 谷氨酰转移酶(- glutamyltransferase, GGT) - 淀粉酶同工酶( -Amylase, AMY),乳酸脱氢酶同工酶(LDH),每种LD同功酶都是由4个亚单位(肽链)组成的四聚物 这些亚单位中, 有两类分别专属M(肌肉)和H(心脏)。H4 = LD1H3M = LD2H2M2 = LD3HM3 = LD4M4 = LD5,六、同工酶电泳,检测方法-琼脂糖电泳法原理:以琼脂糖胶作为介质,LDH可分离出五种同工酶区带,根据其电泳迁移率的快慢, 将迁移最快的命名为 LDH1, 依次为 LDH2, LDH3, LDH4和LDH5,最后
22、显色,扫描确定其百分率。参考值 LDH1 28.4 5.3% LDH2 41.0 5.0% LDH3 19.0 4.0% LDH4 6.6 3.5% LDH5 4.6 3.0%,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15,六、同工酶电泳,七、脑脊液蛋白电泳,琼脂糖凝胶电泳和免疫固定原理相结合,利用高分辨技术在琼脂糖凝胶上对脑脊液蛋白进行电泳分离(血清中的免疫球蛋白的浓度应该被稀释到和脑脊液中Ig一样的浓度：5 至 10 mg/L)。利用与标有过氧化氢酶的特异的抗血清(G, A, M, k, l)之间的免疫反应，免疫球蛋白将会被固定。过氧化氢酶被激活从而进行显色 : 这种显色反应非常灵敏 (最低可以检测到125-250 g/L的微量蛋白)。,1 : 脊髓炎 (0.91) 2 : 多发性硬化症 (2.69) 3 : 由癌症引发的脑炎 (0.70) 4 : 多发性硬化症 (0.63) 5 : 多发性硬化症 (3.60) 6 : 多发性硬化症 (0.74),七、脑脊液蛋白电泳,八、脂蛋白电泳,CAPILLARYS 2,全自动高效液相色谱毛细管电泳仪,Thank you !,
