实验一 薄层层析板的制备.doc

1、实验一 薄层层析板的制备一、 实验目的制备薄层层析板，使叶绿素在层析板上分离显色。二、 实验原理薄层层析，常用 TLC（Chromatography）表示，又称薄层色谱，属于液固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至 0.01 g ）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。 薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大

2、小,一般要求直径为 1040m。硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为： “硅胶 H ”不含粘合剂；“硅胶 G ”含煅石膏粘合剂； “硅胶 HF 254 ”含荧光物质，可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光；“ 硅胶 GF 254 ”既含煅石膏又含荧光剂等类型。 粘合剂除上述的煅石膏（半水合硫酸钙： 2CaSO4 H2O ）外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠。三、 实验材料、器具1、试剂 硅胶、4的 CMC 溶液（羧甲基纤维素钠）2、实验用具：药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒四、实验步骤1、载玻片要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，

3、再用水冲洗干净。 （干净的标准：水不是呈股流下，而是呈瀑布状态流下。 ）2、与硅胶混合：CMCNa 溶液与硅胶的比例为 3:1(3ml：1g) 。取 CMCNa溶液倒入研钵中，然后加入硅胶，在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。3、铺板：将载玻片置于平台上，用药匙舀取糊状硅胶，均匀地铺在载玻片表面。铺板时，可以顺着板中间倒，也可以顺着某个边缘倒，也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上，倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板，表面看上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台

4、面上，否则难保证板面硅胶的厚度均匀。（3g 硅胶大约可铺 7.52.5cm载玻片 5-6块）4、晾干：置水平台上于室温下晾干。5、活化：将晾干的板子在 105烘箱中干燥 30min，然后取出，放入干燥器中，备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能，同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶，主要改变了硅胶内部的微孔结构，使其孔径的大小及微孔结构的排列得到进一步的改善。但是这样硅胶的吸附变大，可能会使样品分离困难。下面先介绍一下配置方法：1. CMCNa 溶液的配置：一般其浓度为 0.30.5，根据自己经验而定（我习惯用 0.4的）。具体方法如下：先将预用的水加热至 6070，然后加入

5、CMCNa，边加边搅拌，使之溶解，即得。2. 与硅胶混合：CMCNa 溶液与硅胶的比例为 3：1。具体方法如下：先将 CMCNa 溶液倒入自动搅拌器或研钵中，然后加入硅胶，搅匀即可。若是在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。3. 铺板：手动或机械。手动铺出的板的薄厚与所加的混合后的硅胶量有关，而机械铺出的板的薄厚与机械所选用的钢板有关，可根据需要来定。但此过程中最关键的是板子边缘铺得好坏，手动铺板一定要将玻璃板边缘硅胶涂匀（我习惯用两头掂法，即板下方的中间垫一物体，两头悬空，两手均匀掂动）。而机械铺板要注意板与板之间平整性，或者由高到低排列。4. 晾干：自然晾干

6、。5. 活化：将晾干的板子在 105烘箱中干燥 30min，取出，放入干燥器中，备用。这是实验室和检验室薄层层析板常用的制备方法之一，供大家参考！层析 英文名称：chromatography定义 1：基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。定义 2：利用某种类型的固定介质，根据混合物分子的电荷大小和分子量不同等性质，在流动相和固定相之间进行分离的一种生物化学技术。层析（chromatography）是“色层分析”

7、的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力在 把 微 细 分 散 的 固 体 或 是 附 着 于 固 体 表 面 的 液 体 作 为 固 定 相 ， 把 液 体 （ 与上 述 液 体 不 相 混 合 的 ） 或 气 体 作 为 移 动 相 的 系 统 中 ， 使 试 料 混 合 物 中 的 各成 分 边 保 持 向 两 相 分 布 的 平 衡 状 态 边

8、 移 动 ， 利 用 各 成 分 对 固 定 相 亲 和 力 不 同所 引 起 的 移 动 速 度 差 ， 将 它 们 彼 此 分 离 开 的 定 性 与 定 量 分 析 方 法 ， 称 为 层析 ， 亦 称 色 谱 法 。 根 据 移 动 相 种 类 的 不 同 ， 分 为 液 体 层 析 、 气 体 层 析 二 种 。用 作 固 定 相 的 有 矽 胶 、 活 性 炭 、 氧 化 铝 、 离 子 交 换 树 脂 、 离 子 交 换 纤 维 等， 或 是 在 硅 藻 土 和 纤 维 素 那 样 的 无 活 性 的 载 体 上 附 着 适 当 的 液 体 ， 也 可 使 用其 他 物 质 。

9、将 作 为 固 定 相 的 微 细 粉 末 状 物 质 装 入 细 长 形 圆 筒 中 进 行 的 层 析 称为 柱 层 析 （ column chromatogra-phy） ， 在 玻 璃 板 上 涂 上 一 层 薄 而 均 的 物质 作 为 固 定 相 的 称 为 薄 层 层 析 （ thin-layer chromatography） ， 后 者 可 与用 滤 纸 作 为 固 定 相 的 纸 上 层 析 进 行 同 样 的 分 析 ， 即 在 固 定 相 的 一 端 ， 点 上 微量 试 料 ， 在 密 闭 容 器 中 ， 使 移 动 相 （ 液 体 ） 从 此 端 渗 入 ， 移 动

10、 接 近 另 一 端 。通 过 这 种 展 开 操 作 ， 各 成 分 呈 斑 点 状 移 动 到 各 自 的 位 置 上 ， 再 根 据 Rf 值 的测 定 进 行 鉴 定 。 当 斑 点 不 易 为 肉 眼 观 察 时 ， 可 利 用 适 当 的 显 色 剂 ， 或 通 过 紫外 灯 下 产 生 荧 光 的 方 法 进 行 观 察 。 也 可 采 用 在 第 一 种 移 动 相 展 开 后 再 用 另 一移 动 相 进 行 展 开 （ 这 时 的 展 开 方 向 应 与 原 方 向 垂 直 ） ， 使 各 成 分 分 离 完 全 的双 相 层 析 （ two-dimensional chr

11、omatography） 。 分 离 后 ， 将 斑 点 位 置 的固 定 相 切 取 下 来 ， 把 其 中 含 有 来 自 试 料 的 物 质 提 取 进 行 定 量 分 析 。 但 为 制 备与 定 量 ， 柱 层 析 则 更 为 适 宜 。 在 柱 层 析 中 ， 移 动 相 从 加 入 试 料 的 一 端 展 开 到达 另 一 端 后 ， 继 续 展 开 使 各 成 分 和 移 动 相 一 起 向 柱 外 分 别 溶 出 ， 这 就 是 广 泛使 用 的 所 谓 洗 提 层 析 （ elution chromatography） 。 层 析 根 据 固 定 相 与 溶质 （ 试 料

12、） 间 亲 和 力 的 差 异 分 为 吸 附 型 、 分 配 型 、 离 子 交 换 型 （ 离 子 交 换 层析 ） 等 三 种 类 型 。 但 这 并 不 是 很 严 格 的 ， 有 时 常 见 到 其 中 间 类 型 。 此 外 ， 近来 也 应 用 亲 和 层 析 ， 即 将 与 基 质 类 似 的 化 合 物 （ 通 常 为 共 价 键 ） 结 合 到 固定 相 上 ， 再 利 用 其 特 异 的 亲 和 性 沉 淀 与 其 对 应 的 特 定 的 酶 或 蛋 白 质 。按 层 析 的 机 理 划 分 ： 吸 附 层 析 、 分 配 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、 凝 胶

13、过 滤 层 析 、 亲 和 层 析 等 。 吸 附 层 析 ： 利 用 吸 附 剂 表 面 对 不 同 组 分 吸 附 性 能 的 差 异 ， 达 到 分 离 鉴 定的 目 的 。 分 配 层 析 ： 利 用 不 同 组 分 在 流 动 相 和 固 定 相 之 间 的 分 配 系 数 不 同 ， 使之 分 离 。 离 子 交 换 层 析 ： 利 用 不 同 组 分 对 离 子 交 换 剂 亲 和 力 的 不 同 。 凝 胶 层 析 ： 利 用 某 些 凝 胶 对 于 不 同 分 子 大 小 的 组 分 阻 滞 作 用 的 不 同 。 按 流 动 相 与 固 定 相 的 不 同 划 分 ： 气

14、相 层 析 、 液 相 层 析 。 这 两 大 类 层 析 是 以 流 动 相 不 同 来 划 分 的 。 如 同 时区 分 流 动 相 和 固 定 相 ， 划 分 为 ： 气 固 层 析 、 气 液 层 析 、 液 固 层 析 和 液 液 层析 等 。 按 操 作 形 式 划 分 ： 柱 层 析 、 纸 层 析 、 薄 层 层 析 、 高 效 液 相 层 析 等 。 柱 层 析 ： 将 固 定 相 装 于 柱 内 ， 使 样 品 沿 一 个 方 向 移 动 而 达 到 分 离 。 纸 层 析 ： 用 滤 纸 做 液 体 的 载 体 ， 点 样 后 ， 用 流 动 相 展 开 ， 以 达 到

15、分 离 鉴定 的 目 的 。 薄 层 层 析 ： 将 适 当 粒 度 的 吸 附 剂 铺 成 薄 层 ， 以 纸 层 析 类 似 的 方 法 进 行 物质 的 分 离 和 鉴 定 。 以 上 划 分 无 严 格 界 限 ， 有 些 名 称 相 互 交 叉 ， 如 亲 和 层 析 应 属 于 一 种 特 殊的 吸 附 层 析 ， 纸 层 析 是 一 种 分 配 层 析 ， 柱 层 析 可 做 各 种 层 析 。基 本 原 理层 析 须 在 两 相 系 统 间 进 行 。 一 相 是 固 定 相 ， 需 支 持 物 ， 是 固 体 或 液 体 。 另 一相 为 流 动 相 ， 是 液 体 或 气

16、体 。 当 流 动 相 流 经 固 定 相 时 ， 被 分 离 物 质 在 两 相 间的 分 配 ， 由 平 衡 状 态 到 失 去 平 衡 到 又 恢 复 平 衡 ， 即 不 断 经 历 吸 附 和 解 吸 的 过程 。 随 着 流 动 相 不 断 向 前 流 动 ， 被 分 离 物 质 间 出 现 向 前 移 动 的 速 率 差 异 ， 由开 始 的 单 一 区 带 逐 渐 分 离 出 许 多 区 带 ， 这 个 过 程 叫 展 层 。 系 数 K 是 物 质 在 两 相 中 的 浓 度 比 。 K 值 大 ， 则 在 固 定 相 中 吸 附 牢 ， K 值小 吸 附 差 。 各 物 质

17、间 的 K 值 差 别 大 ， 则 易 被 分 离 。 不 同 类 型 层 析 的 K 值 含义 不 同 ， 可 视 为 吸 附 平 衡 常 数 ， 分 配 常 数 或 离 子 交 换 常 数 等 。 研 究 层 析 现 象 而 发 展 的 塔 板 理 论 ， 与 有 机 化 学 实 验 中 的 分 馏 法 原 理 有 些相 似 。 被 分 馏 的 有 机 溶 剂 在 分 馏 柱 内 的 填 充 物 上 形 成 许 多 热 交 换 层 ， 从 而 把低 沸 点 溶 剂 先 分 馏 出 来 ， 达 到 纯 化 的 目 的 。 在 层 析 时 用 理 论 塔 板 数 n 来 衡量 层 析 效 能

18、。 tR 为 物 质 在 层 析 柱 上 的 保 留 时 间 ， W 为 洗 脱 下 来 的 物 质 峰 形 的 宽 度 。n 值 愈 大 表 示 层 析 柱 的 效 能 愈 高 。 如 用 理 论 塔 板 高 度 H 表 示 ， 则 包 含 了 层析 柱 长 度 的 因 子 。 式 中 L 为 层 析 柱 的 柱 长 。 H 值 越 大 ， 则 柱 效 越 低 。 此 外 影 响 层 析 分 离 效 果 的 还 有 涡 流 扩 散 、 纵 向 扩 散 和 传 质 阻 抗 等 因素 。 因 此 选 择 层 析 固 定 相 支 持 物 的 粒 度 、 均 匀 度 等 物 理 性 能 ， 流 动

19、相 的 层 析系 统 和 温 度 等 都 是 做 好 层 析 的 关 键几 种 常 用 的 层 析 吸 附 层 析 吸 附 剂 的 吸 附 力 强 弱 ， 是 由 能 否 有 效 地 接 受 或 供 给 电 子 ， 或 提 供 和 接受 活 泼 氢 来 决 定 。 被 吸 附 物 的 化 学 结 构 如 与 吸 附 剂 有 相 似 的 电 子 特 性 ， 吸 附就 更 牢 固 。 常 用 吸 附 剂 的 吸 附 力 的 强 弱 顺 序 为 ： 活 性 炭 、 氧 化 铝 、 硅 胶 、 氧化 镁 、 碳 酸 钙 、 磷 酸 钙 、 石 膏 、 纤 维 素 、 淀 粉 和 糖 等 。 以 活 性

20、 炭 的 吸 附 力 最强 。 吸 附 剂 在 使 用 前 须 先 用 加 热 脱 水 等 方 法 活 化 。 大 多 数 吸 附 剂 遇 水 即 钝 化 ，因 此 吸 附 层 析 大 多 用 于 能 溶 于 有 机 溶 剂 的 有 机 化 合 物 的 分 离 ， 较 少 用 于 无 机化 合 物 。 洗 脱 溶 剂 的 解 析 能 力 的 强 弱 顺 序 是 ： 醋 酸 、 水 、 甲 醇 、 乙 醇 、 丙 酮 、乙 酸 乙 酯 、 醚 、 氯 仿 、 苯 、 四 氯 化 碳 和 己 烷 等 。 为 了 能 得 到 较 好 的 分 离 效果 ， 常 用 两 种 或 数 种 不 同 强 度

21、的 溶 剂 按 一 定 比 例 混 合 ， 得 到 合 适 洗 脱 能 力 的溶 剂 系 统 ， 以 获 得 最 佳 分 离 效 果 。 分 配 层 析 在 支 持 物 上 形 成 部 分 互 溶 的 两 相 系 统 。 一 般 是 水 相 和 有 机 溶 剂 相 。 常 用支 持 物 是 硅 胶 、 纤 维 素 和 淀 粉 等 ， 这 些 亲 水 物 质 能 储 留 相 当 量 的 水 。 被 分 离物 质 在 两 相 中 都 能 溶 解 ， 但 分 配 比 率 不 同 ， 展 层 时 就 会 形 成 以 不 同 速 度 向 前移 动 的 区 带 。 离 子 交 换 层 析 支 持 物 是

22、人 工 交 联 的 带 有 能 解 离 基 团 的 有 机 高 分 子 ， 如 离 子 交 换 树 脂 、离 子 交 换 纤 维 素 、 离 子 交 换 凝 胶 等 。 带 阳 离 子 基 团 的 ， 如 磺 酸 基 （ SO3H） 、 羧 甲 基 （ CH2COOH） 和 磷 酸 基 等 为 阳 离 子 交 换 剂 。 带 阴 离 子 基 团的 ， 如 DEAE（ 二 乙 基 胺 乙 基 ） 和 QAE（ 四 级 胺 乙 基 ） 等 为 阴 离 子 交 换剂 。 离 子 交 换 层 析 只 适 用 于 能 在 水 中 解 离 的 化 合 物 ， 包 括 有 机 物 和 无 机 物 。对 于

23、蛋 白 质 、 核 酸 、 氨 基 酸 及 核 苷 酸 的 分 离 分 析 有 极 好 的 分 辨 力 。 离 子 交 换基 团 在 水 溶 液 中 解 离 后 ， 能 吸 引 水 中 被 分 离 物 的 离 子 ， 各 种 物 质 在 离 子 交 换剂 上 的 离 子 浓 度 与 周 围 溶 液 的 离 子 浓 度 保 持 平 衡 状 态 ， 各 种 离 子 有 不 同 的 交换 常 数 ， K 值 愈 高 ， 被 吸 附 愈 牢 。 洗 脱 时 ， 增 加 溶 液 的 离 子 强 度 ， 如 改 变pH， 增 加 盐 浓 度 ， 离 子 被 取 代 而 解 吸 下 来 。 洗 脱 过 程

24、中 ， 按 K 值 不 同 ， 分成 不 同 的 区 带 。 凝 胶 过 滤 层 析 支 持 物 是 人 工 合 成 的 交 联 高 聚 物 ， 在 水 中 膨 胀 后 成 为 凝 胶 。 凝 胶 内 为 内水 层 ， 凝 胶 周 围 的 水 为 外 水 层 。 控 制 交 联 度 以 形 成 不 同 孔 径 的 网 状 结 构 。 交联 度 小 的 孔 径 大 ， 交 联 度 大 的 孔 径 小 。 凝 胶 只 允 许 被 分 离 物 质 中 小 于 孔 径 的分 子 进 入 ， 大 于 孔 径 的 分 子 被 排 斥 在 外 水 层 ， 最 先 被 洗 脱 下 来 。 而 进 入 孔 径的

25、 分 子 也 按 分 子 量 大 小 大 致 分 离 成 不 同 的 区 带 。 选 择 不 同 规 格 的 凝 胶 ， 可 把一 个 混 合 物 按 分 子 量 的 差 异 分 成 不 同 的 组 分 。 这 种 方 法 曾 被 称 为 分 子 筛 。 目前 常 用 的 凝 胶 商 品 有 ： 葡 聚 糖 凝 胶 （ sephadex） 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 （ bio-gel） 、 琼 脂 糖 凝 胶 （ sepharose） 和 聚 苯 乙 烯 凝 胶 （ styragel） 等 。 亲 和 层 析 在 一 对 有 专 一 的 相 互 作 用 的 物 质 中 ， 把 其 中 之

26、 一 联 结 在 支 持 物 上 ， 用 于纯 化 相 对 的 另 一 物 质 。 常 见 的 亲 和 对 如 ： 酶 和 抑 制 剂 ， 抗 原 和 抗 体 ， 激 素和 受 体 等 。 支 持 物 为 琼 脂 糖 或 纤 维 素 等 。 气 相 层 析 属 于 分 配 层 析 或 吸 附 层 析 ， 仅 适 用 于 分 析 分 离 挥 发 性 和 低 挥 发 性 物 质 。固 定 相 是 在 惰 性 支 持 物 （ 如 磨 细 的 耐 火 砖 ） 上 覆 盖 一 层 高 沸 点 液 体 ， 如 硅油 、 高 沸 点 石 蜡 和 油 脂 、 环 氧 类 聚 合 物 。 外 涂 层 约 为 支

27、 持 物 重 量 的 20 。分 析 时 操 作 温 度 范 围 ， 一 般 从 室 温 到 200 。 特 殊 的 层 析 柱 能 达 到 500 。流 动 相 常 用 氦 、 氩 或 氮 为 展 层 气 体 。 气 相 层 析 分 离 的 区 带 十 分 清 晰 ， 是 由 于挥 发 性 物 质 在 两 相 间 能 很 快 达 到 平 衡 ， 所 需 分 析 时 间 大 为 缩 短 ， 一 般 为 数 分钟 至 10 余 分 钟 。 检 测 记 录 系 统 绘 出 的 各 峰 是 测 定 流 出 气 体 电 阻 变 化 的 结 果 ，因 而 测 定 样 品 量 可 到 微 克 和 毫 微

28、克 水 平 。 具 有 快 速 、 灵 敏 和 微 量 的 优 点 。 气相 层 析 也 能 用 于 分 离 制 备 样 品 ， 但 需 增 加 将 流 出 气 体 通 过 冷 冻 将 分 离 物 回 收的 装 置 。 纸 层 析 以 滤 纸 为 支 持 物 的 分 配 层 析 。 组 成 滤 纸 的 纤 维 素 是 亲 水 物 质 ， 能 形 成水 相 和 展 层 溶 剂 的 两 相 系 统 ， 被 分 离 物 质 在 两 相 中 的 分 配 保 持 平 衡 关 系 。 纸层 析 用 于 分 析 简 单 的 混 合 物 时 可 做 单 向 层 析 。 对 于 复 杂 的 混 合 物 ， 可

29、做 双向 层 析 。 1944 年 A J P 马 丁 第 一 次 用 纸 层 析 分 析 氨 基 酸 ， 得 到 很 好 的 分离 效 果 ， 开 创 了 近 代 层 析 的 发 展 和 应 用 的 新 局 面 。 70 年 代 以 后 ， 纸 层 析 已逐 渐 为 其 他 分 辨 力 更 高 、 速 度 更 快 和 更 微 量 化 的 新 方 法 ， 如 离 子 交 换 层 析 、薄 层 层 析 、 高 效 液 相 层 析 等 所 代 替 。 薄 层 层 析 在 玻 璃 片 、 金 属 箔 或 塑 料 片 上 铺 上 一 层 约 1 2 毫 米 的 支 持 物 ， 如 纤 维素 、 硅 胶

30、 、 离 子 交 换 剂 、 氧 化 铝 或 聚 酰 胺 等 ， 根 据 需 要 做 不 同 类 型 的 层 析 。聚 酰 胺 薄 膜 是 一 种 特 异 的 薄 层 ， 将 尼 龙 溶 解 于 浓 甲 酸 中 ， 涂 在 涤 纶 片 基 上 ，当 甲 酸 挥 发 后 ， 在 涤 纶 片 基 上 形 成 一 层 多 孔 的 薄 膜 ， 其 分 辨 力 超 过 了 用 尼 龙粉 铺 成 的 薄 层 。 薄 层 层 析 较 纸 层 析 优 越 在 于 分 辨 高 ， 展 层 时 间 短 。 例 如 用 纸层 析 做 氨 基 酸 分 析 ， 往 往 需 要 两 天 时 间 ， 而 且 对 层 析 条

31、 件 要 求 严 格 ， 不 易 得到 满 意 的 分 离 效 果 。 如 用 薄 层 层 析 做 ， 一 般 约 需 半 小 时 ， 分 离 效 果 更 好 。 薄层 层 析 一 般 用 于 定 性 分 析 。 也 能 用 于 定 量 分 析 和 制 备 样 品 。 高 效 液 相 层 析 （ 又 名 高 压 液 相 色 谱 ） 70 年 代 新 发 展 的 层 析 法 。 其 特 点 是 ： 用 高 压 输 液 泵 ， 压 强 最 高 可 达5000psi（ 相 当 于 34 个 标 准 大 气 压 ） 。 用 直 径 约 3 10 微 米 的 超 细 支 持 物装 填 均 匀 的 不 锈

32、 钢 柱 。 常 用 的 支 持 物 是 在 玻 璃 小 珠 上 涂 一 层 1 2 微 米 的二 氧 化 硅 ， 经 硫 酰 氯 反 应 生 成 SiCl， 进 一 步 连 接 疏 水 的 烷 基 ， 如 SiC18H37， 或 阳 离 子 交 换 基 团 Si（ CH2） nC6H4SO3H， 或 阴 离 子 交 换 基 团Si（ CH2） nNH2。 这 种 支 持 物 能 承 受 很 高 的 压 力 ， 化 学 性 能 稳 定 。 用 不 同类 型 支 持 物 的 HPLC， 可 做 吸 附 层 析 、 离 子 交 换 层 析 和 凝 胶 过 滤 层 析 。 其 分析 微 量 化 可

33、达 10-10 克 水 平 。 但 用 于 制 备 ， 可 以 纯 化 上 克 的 样 品 。 展 层 时 间短 ， 一 般 需 几 分 钟 到 10 余 分 钟 。 其 分 析 速 度 、 精 确 度 可 与 气 相 层 析 媲 美 。HPLC 适 于 分 析 分 离 不 挥 发 和 极 性 物 质 。 而 气 相 层 析 只 适 用 于 挥 发 性 物 质 ， 两者 互 为 补 充 ， 都 是 目 前 最 为 理 想 的 层 析 法 。 HPLC 配 有 程 序 控 制 洗 脱 溶 剂 的梯 度 混 合 仪 ， 数 据 处 理 的 积 分 仪 和 记 录 仪 等 电 子 系 统 ， 成 为

34、 一 种 先 进 的 分析 仪 器 ， 在 生 物 化 学 、 化 学 、 医 药 学 和 环 境 科 学 的 研 究 中 发 挥 了 重 要 作 用 。 反 相 层 析 在 吸 附 层 析 中 ， 高 极 性 物 质 在 层 析 柱 上 吸 附 较 牢 ， 洗 脱 时 发 生 拖 尾 现 象和 保 留 时 间 长 的 问 题 。 如 果 在 支 持 物 上 涂 上 一 层 高 碳 原 子 的 疏 水 性 强 的 烷烃 类 ， 洗 脱 液 用 极 性 强 的 溶 剂 ， 如 甲 醇 和 水 的 混 合 物 。 则 被 分 离 样 品 中 的极 性 强 的 物 质 不 被 吸 附 ， 最 先 洗

35、 下 来 ， 得 到 较 好 的 分 离 效 果 。 这 种 层 析 法 与普 通 的 吸 附 层 析 法 相 反 ， 故 称 为 反 相 层 析 。 目 前 用 HPLC 做 反 相 层 析 常 用 的ODS 柱 ， 即 在 支 持 物 的 表 面 上 连 接 了 C18H37Si基 团 。 同 系 层 析 在 核 酸 分 析 中 ， 将 样 品 经 核 酸 酶 部 分 裂 解 成 不 同 长 度 的 核 苷 酸 片 段 ，用 同 位 素 标 记 后 ， 在 DEAE 纤 维 素 薄 层 上 分 离 ， 用 含 有 未 标 记 的 相 同 的 核 苷酸 片 段 作 展 层 溶 剂 ， 这 样

36、 ， 未 标 记 的 核 苷 酸 把 标 记 过 的 核 苷 酸 推 进 ， 使 按 分子 量 大 小 不 同 把 标 记 核 苷 酸 片 段 ， 按 由 小 到 大 的 次 序 排 列 ， 达 到 分 离 的 目 的 。于 是 把 这 种 层 析 法 称 为 同 系 层 析 。 同 系 层 析 和 电 泳 相 结 合 曾 用 于 寡 核 苷 酸 的顺 序 分 析 。 纸 层 析 是 层 析 法 的 一 种 ,要 了 解 纸 层 法 还 得 从 层 析 法 开 始 .层 析 法 又 称色 层 分 析 法 或 色 谱 法 （ Chromatography） ， 是 一 种 基 于 被 分 离 物

37、 质 的 物 理 、化 学 及 生 物 学 特 性 的 不 同 ， 使 它 们 在 某 种 基 质 中 移 动 速 度 不 同 而 进 行 分 离 和分 析 的 方 法 。 例 如 ： 我 们 利 用 物 质 在 溶 解 度 、 吸 附 能 力 、 立 体 化 学 特 性 及分 子 的 大 小 、 带 电 情 况 及 离 子 交 换 、 亲 和 力 的 大 小 及 特 异 的 生 物 学 反 应 等 方面 的 差 异 ， 使 其 在 流 动 相 与 固 定 相 之 间 的 分 配 系 数 （ 或 称 分 配 常 数 ） 不 同 ，达 到 彼 此 分 离 的 目 的 。 层 析 法 的 最 大

38、特 点 是 分 离 效 率 高 ， 它 能 分 离 各 种 性 质 极 相 类 似 的 物 质 。而 且 它 既 可 以 用 于 少 量 物 质 的 分 析 鉴 定 ， 又 可 用 于 大 量 物 质 的 分 离 纯 化 制 备 。因 此 ， 作 为 一 种 重 要 的 分 析 分 离 手 段 与 方 法 ， 它 广 泛 地 应 用 于 科 学 研 究 与 工业 生 产 上 。 现 在 ， 它 在 石 油 、 化 工 、 医 药 卫 生 、 生 物 科 学 、 环 境 科 学 、 农 业科 学 等 领 域 都 发 挥 着 十 分 重 要 的 作 用 。 层 析 根 据 固 定 相 基 质 的 形 式 分 类 ， 层 析 可 以 分 为 纸 层 析 、 薄 层 层 析和 柱 层 析 。 其 中 纸 层 析 是 指 以 滤 纸 作 为 基 质 的 层 析 。