手足口病预防控制指南(2009版).doc

1、1手足口病预防控制指南（2009 版）手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。手足口病常出现暴发或流行，为指导各地做好手足口病的预防控制工作，制定本指南。一、目的（一）指导医疗机构、疾病预防控制机构开展疫情报告与监测。（二）指导疾病预防控制机构开展流行病学调查、病原学监测。（三）指导疾病预防控制机构、医疗机构开

2、展重点场所及公众预防控制工作。二、疾病概述（一）病原学。引起手足口病的病毒属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒 A 组 （Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B 组（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；肠道病毒 71 型（Human Enterovirus 71, EV71）；埃可病毒（Echovirus, ECHO）等。其中以 EV71 及2CVA16 型较为常见。肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，75%酒精和5%来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感；对紫外线和干燥敏感，各种氧化剂

3、(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及 5630 分钟可以 灭活病毒。病毒在 4可存活 1 年，-20可 长期保存，在外 环境中可长期存活。（二）流行病学。1传染源。人是人肠道病毒的唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源，隐性感染者难以鉴别和发现。发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。2传播途径。肠道病毒可经胃肠道（粪-口途径）传播，也可经呼吸道（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播。尚不能明确是否可经水或食物传播。3易感性。人对人肠道病毒普遍易感。不同年龄组均可感染发病，以 5 岁及以下儿童为

4、主，尤以 3 岁及以下儿童发病率最高。显性感染和隐性感染后均可获得特异性免疫力，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同血清型病毒产生比较牢固的免疫力，但不同血清型间鲜有交叉免疫。4流行特征。该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般 5-7 月 为发病高峰。托幼机构等易感人群集中单位可发生暴发。肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，控制难度大，容易出现暴发和短时间内较大范围3流行。（三）临床表现。手足口病潜伏期为 2-10 天，平均 3-5 天，病程一般为 7-10 天。急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围可有炎性红晕，疱内液体较

5、少。可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。部分患者无发热，仅表现为皮疹或疱疹。一般预后良好；少数病例，特别是 EV71 感染患儿，可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、神经源性肺水肿、循环障碍等，病情凶险，可致死亡或留有后遗症。（四）治疗原则。目前无特异性治疗方法，以支持疗法为主，绝大多数患者可自愈。目前尚无特异性的疫苗。病例的治疗方法参考卫生部手足口病诊疗指南（2008 年版）。三、病例定义（一）临床诊断病例。在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见。1普通病例：发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热。2重症病例：出现神经系统受累、呼吸及循环功能障碍等表现，实验室检查可有外周血白细胞增高、脑脊

6、液异常、血糖增高，脑电图、脑脊髓磁共振、胸部 X 线、超声心动图检查可有异常。极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合实验4室检测做出诊断。若无皮疹，临床不宜诊断为手足口病。（二）实验室确诊病例。临床诊断病例符合下列条件之一者，即可诊断为实验室确诊病例：1自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）。2自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中检测到CVA16 或 EV71 特异性核酸，或从脑 脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本等标本

7、中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸。3血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴度1256，或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高。（三）聚集性病例。1 周内，同一托幼机构或学校等集体单位发生 5 例及以上手足口病病例；或同一班级（或宿舍）发生 2 例及以上手足口病病例；或同一自然村发生 3 例及以上手足口病病例；或同一家庭发生 2 例及以上手足口病病例。四、疾病监测（一）疫情报告。51个案报告。各级各类医疗机构应按照中华人民共和国传染病防治法和传染病信息报告管理规范的有关规定，对符合病例

8、定义的手足口病病例进行报告。如为重症病例，请在“重症患者” 处选择 “是”；如为实验室诊断病例，请在“实验 室结果” 处选择相 应的肠道病毒病原学分型信息。实行网络直报的医疗机构应于 24 小时内进行网络直报，未实行网络直报的医疗机构应于 24 小时之内寄送出传染病报告卡。2聚集性病例报告。托幼机构和学校、医疗机构发现手足口病聚集性病例时，应以最快的方式向县（区）级疾病预防控制机构报告。3. 突发公共卫生事件报告。局部地区或集体单位发生流行或暴发时，按照突发公共卫生事件应急条例、 全国突发公共卫生事件应急预案、 突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法及有关规定，及时进行突发公共卫生事

9、件信息报告。（二）病原学监测。各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监测，了解病原动态分布变化。所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县（区）为单位，每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于 5 例时，全部采样。以省（区、市）为单位,在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份6血清,以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将

10、毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。具备测序条件的省份，可开展 VP1 基因序列测定和分析，进行基因定型，序列测定完成后将序列结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心；不具备测序条件者，将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定，中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果。所有病例的采样均由医疗机构完成，及时送至县（区）级疾病预防控制机构或指定的检测机构检测。检测机构将实验室检测结果于 24 小时内反馈给县（区）级疾病预防控制机构；县（区）级疾病预防控制机构接到结果后，于 24 小时内对检测病例的传染病报告卡信息进行订正，将其病例类型订正为“实验室

11、诊断” ，并在“ 实验 室结果”处补填肠道病毒病原学分型信息。各种标本采集和检测方法详见手足口病标本采集及检测技术方案（附件 1）。（三）监测信息分析与反馈。各级疾病预防控制机构要每日对网络直报系统进行浏览，及时对报告的病例进行审核、查重、订正等工作，定期对监测数据进行分析，判断发病趋势，发现异常升高或病例呈聚集性分布或出现重症及死亡病例时，要及时核实并向同级卫生行7政部门及上级疾病预防控制机构报告，并定期向下级疾病预防控制机构和医疗机构反馈疫情分析信息。五、预防控制（一）现场调查处置。发现手足口病聚集性病例、重症或死亡时，县（区）级及以上疾病预防控制机构要立即组织开展现场调查处置。1流行病学

12、调查。（1）聚集性病例调查：了解聚集性病例的临床表现、流行特征，以分析流行因素，为采取防控措施提供依据。要对首发或指示病例开展流行病学调查，填写手足口病个案调查表（附件 2）。（2）重症或死亡病例调查：详细了解病例的基本信息、临床症状、发病就诊治疗过程、感染传播情况、病原检测结果，以分析重症及死亡病例的主要危险因素，填写手足口病重症或死亡病例个案调查表（附件 3）。调查结束后，各省级疾病预防控制中心应将结果录入统一数据库，报送中国疾病预防控制中心。（3）专题调查：根据当地手足口病疫情特点及流行特征，可开展专题调查，以了解当地的主要传播方式以及感染危险因素等，为制定干预措施提供依据。专题调查的方

13、案及其内容，应根据调查目的专门设计。（4）医疗机构要协助疾病预防控制机构对病例进行流行病学调查。2传染源的管理。8患儿应及时就医，并遵医嘱采取居家或住院方式进行治疗。居家患儿，家长或监护人应在社区（村）医生的指导下，密切关注患儿的病情变化，如发现神经系统、呼吸系统、循环系统等相关症状时，应立即送医院就诊，同时，要尽量避免与其他儿童接触。住院患儿应在指定区域内接受治疗，防止与其他患儿发生交叉感染。管理时限为自患儿被发现起至症状消失后 1 周。乡镇卫生院/社区卫生服务中心、村卫生室/社区卫生服务站等负责本辖区居家治疗的手足口病患儿的随访工作，掌握居家治疗患儿的病情进展情况。3标本采集和检测。（1）

14、所有重症和死亡病例均要采集标本，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测。（2）医疗机构负责样本采集，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。（3）疾病预防控制机构根据本地的技术能力，对采集的标本开展核酸检测、病毒分离；不具备技术条件时，及时送上级机构进行检测（附件 1）。4消毒措施。病家、托幼机构和小学的消毒应在当地疾病预防控制机构的指导下，由单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制机构负责对其进行消毒处理。医疗机构的消毒由医疗机构安排9专人进行。消毒方法参见消毒技术规范

15、（2002 版）和手足口病疫源地消毒指南（附件 4）。5健康教育。各级医疗卫生机构应在政府领导下，与当地教育、宣传、广电等部门密切合作，充分利用 12320 公共卫生公益热线、广播、电视、报纸、网络、手机短信、宣传单/宣传画等多种方式，开展手足口病防治知识的宣传工作，使 5 岁以下儿童家长及托幼机构工作人员等了解手足口病的临床症状，掌握最基本的预防措施，强调保持良好的个人卫生习惯及环境卫生措施对于有效预防手足口病的重要性，动员托幼机构老师和管理人员、儿童家长成为手足口病防控工作的主动参与者，形成群防群控。与重症或死亡病例发病前 1 周或发病后有共同生活、居住史的 5 岁以下儿童，要对其家长或监

16、护人进行健康教育，做好儿童的密切观察，出现症状要及时就诊和治疗。（二）重点人群及重点机构的预防控制措施。为降低人群手足口病的发病率，减少聚集性病例，避免医院感染，各地要做好以散居儿童为主的重点人群和以托幼机构、医疗机构为主的重点场所的预防控制工作。1散居儿童的预防控制措施。（1）饭前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等给儿童洗手；看护人接触儿童前、替幼童更换尿布、处理粪便后均要洗手；（2）婴幼儿的尿布要及时清洗、曝晒或消毒；注意保持家庭环境卫生，居室要经常通风，勤晒衣被；10（3）婴幼儿使用的奶瓶、奶嘴及儿童使用的餐具使用前后应充分清洗、消毒；不要让儿童喝生水、吃生冷食物；（4）本病流行期间不宜

17、带儿童到人群聚集、空气流通差的公共场所；避免接触患病儿童；（5）儿童出现发热、出疹等相关症状要及时到医疗机构就诊；（6）居家治疗的患儿避免与其他儿童接触，以减少交叉感染；父母要及时对患儿的衣物进行晾晒或消毒，对患儿粪便及时进行消毒处理。2托幼机构预防控制措施。（1）每日进行晨检，发现可疑患儿时，要采取立即送诊、居家观察等措施；对患儿所用的物品要立即进行消毒处理；（2）出现重症或死亡病例，或 1 周内同一班级出现 2 例及以上病例，建议病例所在班级停课 10 天；1 周内累计出现 10例及以上或 3 个班级分别出现 2 例及以上病例时，经风险评估后，可建议托幼机构停课 10 天；（3）教育、指导

18、儿童养成正确洗手等良好的卫生习惯；老师要保持良好的个人卫生状况；（4）教室和宿舍等场所要保持良好通风；定期对玩具、儿童个人卫生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品进行清洗消毒；（5）定期对活动室、寝室、教室、门把手、楼梯扶手、桌面等物体表面进行擦拭消毒；（6）托幼机构应每日对厕所进行清扫、消毒，工作人员应戴手套，工作结束后应立即洗手；11（7）托幼机构应配合卫生部门采取手足口病防控措施。3医疗机构的预防控制措施。（1）各级医疗机构应加强预检分诊，专辟诊室（台）接诊发热、出疹的病例。增加候诊及就诊等区域的清洁消毒频次，室内清扫时应采用湿式清洁方式；（2）医务人员在诊疗、护理每一位病例后，均应认真洗手

19、或对双手消毒，或更换使用一次性手套；（3）诊疗、护理手足口病病例过程中所使用的非一次性仪器、体温计及其他物品等要及时消毒；（4）对住院患儿使用过的病床及桌椅等设施和物品必须消毒后才能继续使用；（5）患儿的呼吸道分泌物和粪便及其污染的物品要进行消毒处理。附件：1手足口病标本采集及检测技术方案2手足口病个案调查表3手足口病重症或死亡病例个案调查表4手足口病疫源地消毒指南12附件 1 手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。采集病人发病 3 日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量 5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签， 4

20、暂存 12 小时内送达实验室，-20 以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（二）咽拭子标本。采集病人发病 3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的 15ml 外螺旋盖采 样管中，在靠近 顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4暂存并在 12 小时内送达实验室，-20以下低温冷 冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均 应 采集 EV71 和

21、 CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（ 发 病 0-7d）和恢复期（发 病 14-30d）双份配 对 血清用于 阐 明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的 动态变 化， 评 价血清学抗体 试剂 盒的敏感性和特异性。 静脉采集 3-5ml 全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中，外表 贴 上 带 有唯一13识别 号 码 的 标签。将血清置于-20以下冰箱中冷 冻保存。（四）疱疹液。在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用 75%的酒精对疱

22、疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h 内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（五）肛拭子标本。采集病人发病 3 日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有 35ml 保存液（含 5%牛血清 细胞维持液）的 15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别

23、号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取 2-3 份约 5-10g 的组织，淋巴 结 2 个，分别置于 15ml-50ml 无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后 3 天内，采集量为 1.0-142.0ml。采集后立即装入无菌 带垫圈的冻存管中， 4暂存立即(12h 内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存

24、的标本存于70冰箱。但 EV71 感染神经系统时，很难 在脑脊液中检测到 EV71病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12 小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B 类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市 级 CDC 实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到

25、病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含 5%牛血清维持液。用于分子生物学 诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：保存液Eagles 液(MEM) 80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml15胎牛血清 5.0ml7.5%NaHCO3溶液 3.5ml青、链霉素（各 10000U/ml）10ml三、实验室检测操作流程（一）病毒分离。1.试剂配置（1）细

26、胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维持液（MM）Eagles 液(MEM) 86.5ml 92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml 1.0ml胎牛血清 10.0ml 2.0ml7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml青、链霉素（各 10000U/ml）1.0ml 1.0ml（2）粪便标本和肛拭子的处理液完全 PBS 液中加入 PS 溶液，终浓度为青霉素 100 单位/ml，链霉素为 100g/ ml。完全 PBS 液的配置：取以下 1 份 B 液和 1 份 C 液加到 8 份 A 液中即为完全 PBS 工作液。A 液：试剂品名 加入量NACL 8.00gKCL 0.

27、20gNa2HPO4(无水) 0.91gKH2PO4 0.12g16用 600800ml 蒸馏水溶解以上 盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15 分钟高压灭菌，即为不完全 PBS 工作液（不含钙、 镁离子）。B 液：试剂品名 加入量MgCl2.6H2O 0.10g溶解于 100ml 蒸馏水中，10psi（70Kpa）15 分钟高压灭菌。C 液： 试剂品名 加入量CaCl2 0.10g溶解于 100ml 蒸馏水中，10psi（70Kpa）15 分钟高压灭菌。2病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如 EV71、CVA16）生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含

28、 EV71、CVA16 等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系： RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。 HEp-2细 胞，来源于人喉癌上皮细胞。3标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入 10ml PBS、1g 玻璃珠、 1ml 氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约 2g 加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为 2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于20；175）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡 20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在 1500g

29、条件下离心 20min；7）在生物安全柜中将每 1 份标本的上清液分别吸入 2 个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理 1 次）；8） 1 管粪 便悬液冻存于 20作为备份，另 1 管存于 4-8以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于 RNA 提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在 4条件下，10000 rpm 离心 20min，用

30、上清接种到细胞上或直接提取 RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4接种和观察（病毒分离）（1）通常使用ml 的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液 1.5ml。显微镜下 观察单层细胞，以确保 细胞是健康、无 污染的。一个健康的单层细胞会在传代后 48 小时左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上 1-1.2ml 的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种 2 支 RD 细胞和 2 支 HEp-2 细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；18（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（5）每支试管接种 0.2ml 的标本悬液，培养温度要求 36。（或者

31、使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种 0.2ml 的 标本悬液，培养温度 为 36；吸附 1 小时后，换上 1.5ml 的维持液（MM）。同样每份标本需同 时接种 2 支 RD 细胞和 2支 HEp-2 细 胞。（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+4+）、提示细胞受毒性反应、老化或 污染的影响而发生的变化（1+，25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；（

32、8）如果有特征性的肠道病毒 CPE 出现，要如实记录，并观察直到 75%的细 胞发生变化（3+ CPE），然后 储藏在20以备二次传代；（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后20或70冻存；（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的 CPE 出现，将病毒保存在20冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；（11）如果 7d 之后没有 CPE 出现，那么盲 传 1 代继续观察 7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；（12）盲传两代后，仍然没有出现 CPE 的，则 判定为阴性；（13

33、）注意：如果接种后 24h 内出现 CPE，很可能是标本中的非特异19性成分导致的毒性反应。取 100l 阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐 1h 后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；（14）几个概念：A：毒性反应：如果在接种后 1-2d 内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取 0.2ml 接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用 PBS 稀释 10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒

34、造成的 CPE 无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。C：盲 传 ：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。 这时已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取 0.2ml 接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察 7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生 CPE，那么认为这个 标本是阴性的。5病毒分离结果解释RD 细 胞支持 HFMD 的主要病原体CVA16 和 EV71 等多种肠道病毒的复制，CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表 现为细胞 圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细

35、 胞自管壁脱落。但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD 细胞中生长的速度不同，EV71 的生长速度要快于 CVA16，表现为 EV71 感染 RD 细胞后出 现 CPE 的时间比 CVA16 早， EV71 接种细胞后出现CPE 很快，但 CVA16 一般要经过 2 次以上 传代才出现明显的 CPE。若在使用 RD 细胞分离的同时再增加 HEp-2 细胞，可提高肠道病20毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体，如一些柯萨奇 B 组病毒）。但 CVA16 和 EV71 在 HEp-2 细胞中均不繁殖。（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗

36、体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在 评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71 原型株 为 BrCr 株，CVA16 原型株为 G-10 株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。使用对肠道病毒敏感的细

37、胞，如 RD 细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的 C 液，可用维持液代替）稀 释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100 CCID 50/0.05ml）要事先测定。中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现 CPE，特异性中和抗体与病毒 结合后，可使病毒 颗粒失去感染性，抑制 CPE 的出现。1液体配制A 液：血清处理液：（100ml 中含下列试剂成份）21MEM 85ml3% L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氢钠 2ml胎牛血

38、清 2ml青、链霉素（各 10000U/ml） 10mlB 液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml 中含下列试剂成份）MEM 85ml3% L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氢钠 2mlHEPES 1ml胎牛血清 10ml青、链霉素（各 10000U/ml） 1mlC 液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml 中含下列液体）MEM 93ml3% L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氢钠 2mlHEPES 1ml胎牛血清 2ml青、链霉素（各 10000U/ml） 1ml2攻击病毒 CCID50滴定和滴度梯度制备（1）将增殖后的病毒悬液冻融 3 次，然后在 4、12000rpm

39、条件下离心 10min，取上清液分装于 10 支冻存管中，每管 1.5ml，一般每管应22在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；（2）加 Eagle 液 10 倍系列稀释为 10-1至 10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔 50l，每稀 释 度 4 孔细胞；（3）每孔加细胞悬液 50l，同时设细胞对照（50l 稀释液+50l细胞悬液）， 36培养 7d，观察细胞病变；（4）按 Behrens-Krber 公式计算出分离病毒株的 CCID50；log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：L = 实验 中使用的最低稀释度的对数值；d = 稀释梯度的 对数值； S = 终判时阳性部分的总

40、和（即出现 CPE 的细胞孔所占的比例之和）。（5）正式试验前应先滴定攻击病毒 2-3 次，取其平均 值，求出每0.05ml 中含 100 CCID50的病毒载量；（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即 100 CCID50/0.05ml）；（7）取 3 支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的 C 液）0.9ml；（8）用带滤芯的吸尖（ART 吸尖）吸 0.1ml 已经稀释好的攻击病毒液（即 100CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支 ART 吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至 1 CCID50/0.05ml 和 0

41、.1 CCID50/0.05ml。233稀释血清（1）发病 1-3d 内采取患者急性期血清，发病后 2-4 周采取恢复期血清，分别冻 存在-20备检。（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的 A 液）0.3ml，加待测血清 0.1ml，盖紧塞子，震摇 混匀，放 4 冰箱过夜，即 为 1：4 稀释血清。次日 56、30min 灭活。（3）打开独立无菌包装 48 孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的 C 液）0.3ml，每份血清使用一排，每排 4 孔。使用移液器吸取处理过的血清 0.1ml 加入第一孔（即为 1：16），吹吸

42、8-10 次，吸 0.1ml 加入第二孔（即 为 1：64），依次至 1：1024，血清稀 释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行 4 倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。4病毒中和抗体测定的操作步骤：（1）取一块 96 孔板横向使用，每块板可以做 8 份（4 对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2 孔（B1-B2 、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入 1:1024 稀释 度的待测血清 0.05ml，不必更换吸尖，在 A3-A4 孔（B3-B4 、C3-C4、

43、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入 1:256 稀释度的待测血清 0.05ml，A5-A6 孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64 稀释度的待测血清 0.05ml，A7-A8 孔（B7-B8、C7-C8 、D7-D8、E7-24E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入 1:16 稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10 孔（B9-B10、C9-C10 、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入 1:4 稀释度的待测血清 0.05ml，A

44、11-A12 孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀 释液 0.05ml；（2）上述孔中分别加入病毒 0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为 100 CCID50/0.05ml）；（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入 36 CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一块 96 孔板纵向使用，做 100 CCID50/0.05ml 病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的 C 液）0.05ml，然后从 0.1 CCID50/0.05ml 加起，每孔 0.05ml，每

45、个稀释度 8 孔，不必更换吸尖，一直加至 100 CCID50/0.05ml；同时留出 4 孔做为细胞对照孔，每孔加入 0.1ml 病毒稀释液，然后放入 4冰箱中暂存；25（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为 2105个/ml，每块 96 孔板至少需要准备 10ml；（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入 0.1ml 细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入 36 CO 2孵箱中孵育培养；（7）使用倒置显微镜每天观察 CPE，并 记录病毒滴定 结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当

46、100 CCID50/0.05ml 的病毒 对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约 57d）；（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在 32320 CCID50/0.05ml 的范围 内，实验无效，就要重复实验。5结果判定当最高稀释度血清的 2 孔中有 1 孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变， 该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度 2 孔完全病变，相邻低稀释度 2 孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现 1 孔细胞病变，另 1 孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。对于 HFMD 的

47、双份血清中和实验结果来说 ，如果恢复期血清 较急性期血清 EV71 或 CVA16 中和抗体滴度出 现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于 1:256 也有诊断意义，26血清中和抗体滴度为 1:128 判定为可疑阳性。（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。1RNA 提取可使用多种商业化试剂盒来提取 RNA，针对临 床标本应选择质量较高的“用于 临床标本病毒 RNA 提取的试剂 盒”，也可使用全自动RNA 提取仪进行提取。针对病毒

48、分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化 RNA 提取试剂盒都可有效的提取到 RNA。RNA 提取依据使用的试剂不同， 严格按说明书进行操作。2逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR ）（1）引物序列合成国家脊灰实验室自行设计 3 对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71 特异性引物和 CVA16 特异性引物。各省 CDC 依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级 CDC。1）人肠道病毒（包括 EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：PE2（上游）：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3PE1

49、（下游）：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -32）EV71 核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -327EV71-A（下游）：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -33）CVA16 核酸检测引物序列：CVA16-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3CVA16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3（2）实验设计1）在 PCR 记录纸 （实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴 定标本的名称以及标本的顺序，与 PCR 仪排列的顺序一致。2）标记好加标本和对照的 PCR 管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。A：阳性对照：参比 RNA，省级 CDC 提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。B：阴性对照：使用正常细胞