1、素材聚合酶链式反应 PCR（生物学的聚合酶链反应）一般指聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点，是能将微量的 DNA 大幅增加。由 1983 年美国Mullis 首先提出设想，1985 年由其发明了聚合酶链反应，即简易 DNA 扩增法，意味着 PCR技术的真正诞生。到如今 2013 年，PCR 已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的 Taq DNA 聚合酶，为 PCR 技术发展也做出了基础性贡献。PCR(聚合酶链式反应）是利用 DNA 在体外摄氏 95高温时变性会变
2、成单链，低温（经常是 60C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度（72C 左右），DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。真核生物的启动子由于真核生物中有三种不同的 RNA 聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA 框，GC 框，CATT 框，OCT 等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白 H2B；有的只有 TATA 框和 GC 框，如 SV40 早期转
3、录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和 RNA pol 结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。 (一)类基因的启动子和调控区类基因的启动子由核心元件和上游元件组成。核心元件包括 TATA 框和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）。亚克隆（英语：subcloning）是一种分子生物学技术。亚克隆：(subclone) 分为细胞克隆和分子克隆。该技术旨在将目的基因导入目标载体中，以进行进一步研究。值得注意的是，亚克隆和分子克隆（mo
4、lecular cloning）不是同一概念。在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。在分子克隆中，从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆。亚克隆就是初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来。对已经获得的目的 DNA 片段进行重新克隆，其目的在于对目的 DNA 进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的 DNA 片段和载体的制备；(2)目的 DNA 片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。亚克隆技术：限制性内切酶是一类能识别双链
5、 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。首先，使用限制酶将目的基因切下。切下来的目的基因需经过纯化（常用手法是凝胶分离法）。之后，可以通过 PCR 来制造一定数量的该目的基因的拷贝。同时，需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体，以让载体产生与目的基因互补的黏性末端，以使得它们能在后续步骤中被 DNA 连接酶连接。磷酸酯酶（通常是小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP）在该过程中也必不可少，因为它能防止载体的自身黏合。之后，再对目标载体进行分离/纯化。接下来，将目的基因与载体混合，并添加 DNA 连接酶。通常，目的基因和载体的分子数之比设定为 5 比 1 或
6、10 比 11（也有文献认为应为 3 比 12）。目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。另外，目的基因也不应过长。超过 10kb（千碱基对）的话，目的基因将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚促卵泡激素糖蛋白激素， 多肽识别其他数据基因座 11 p13促卵泡激素（英语：follicle-stimulating hormone, FSH，亦称为卵泡刺激素）是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的
7、一系列生理过程。促卵泡激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。结构促卵泡激素是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由 和 两条多肽组成。黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素采用了与促卵泡激素相似的结构。它们共享同样的 亚基（含 92 位氨基酸残基），而 亚基则随激素的不同而不同。促卵泡激素的 亚基含有 118 位氨基酸残基，负责与促卵泡激素受体的相互作用。促卵泡激素表面的糖基化涉及海藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、以及硅铝酸。其中，硅铝酸与促卵泡激素的生物半衰期紧密相关。促卵泡激素的半衰期为 3 至 4 小时。促卵泡激素的分子量约为 3
8、0000Da。基因促卵泡激素 亚基的基因位于染色体 6p21.1-23，在多种不同细胞中有表达； 亚基的基因位于染色体 11p13，在脑垂体细胞中表达，受促性腺激素释放激素的控制，被抑制素所抑制，被激活素所增强。活性促卵泡激素调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程，特别是刺激生殖细胞的成熟。在女性体内在卵巢中，促卵泡激素刺激尚未成熟的卵泡的生长，直至成熟为格拉夫卵泡。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断促卵泡激素的进一步合成。这一机制保证了排卵的选择性。在黄体化阶段的末尾，促卵泡激素水平也有小幅度提升，可能与下一个排卵周期的开始有关。在男性体内编辑在睾丸中，促卵泡激素提
9、高塞尔托利氏细胞合成男性激素结合蛋白的水平，诱发塞尔托利细胞的紧密结合，同时分泌抑制素，在成精子过程中起到至关重要的作用。作用机理编辑促卵泡激素的目标细胞表面表达有促卵泡激素受体，属于 G 蛋白偶联受体家族。促卵泡激素与其受体蛋白的结合将导致后者的构象变化。作为跨细胞膜的膜蛋白，促卵泡激素受体胞外的变构将引发胞内的变构，改变其与 G 蛋白的结合状态，并通过其它蛋白的参与，进一步诱发环磷酸腺苷等第二信使的生成，将信号传至细胞核内，实现对蛋白表达和细胞发育进程的调节。相关疾病编辑促卵泡激素水平在儿童期较低，而在女性的更年期之后则很高。高促卵泡激素水平编辑促卵泡激素的高水平预示着性腺引发的限制性反馈
10、(负反馈)缺失，导致脑垂体不断合成促卵泡激素。这在女性接近或处于更年期时属于正常现象，但对于处于生育年龄的女性则是不正常的，可能是以下疾病的信号：过早绝经也称为卵巢早衰性腺障碍或 Turner 综合征阉割斯外尔综合征先天肾上腺增生的某些病例睾丸失效低促卵泡激素水平编辑促卵泡激素分泌水平的降低将导致性腺功能的缺失。在男性精子数量不足的病症中尤为典型。在女性中表现为生育周期的停止，具体相关的疾病有:多卵囊巢综合征，可能的体征有肥胖，多毛，不育等等；考曼综合征下丘脑抑制症垂体机能减退症泌乳激素过多症性腺功能低下症正在接受性腺抑制治疗使用促性腺激素释放激素结抗剂使用促性腺激素释放激素促进剂（负调节）医
11、疗应用编辑促卵泡激素可在绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达得到。临床用于对不育症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟，同时也用于体外人工受精和体内人工受精的相关治疗中。促卵泡激素受体FSHR 基因位于人的 2 号染色体上 p21 区，长约 2080 个核苷酸调控序列（英语：Regulatory sequence，又译调节序列）是 DNA 中一段包含启动子、增强子，以及其他可与调节蛋白，如转录因子结合的位置。这些序列调控了基因的表现，进而影响蛋白质的生产。除此之外，mRNA 也有调控序列，可与 RNA 结合蛋白或其他 RNA 结合DNase I，即 Deoxyribonu
12、clease I，脱氧核糖核酸酶 I，是一种可以消化单链或双链DNA 产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I 水解单链或双链 DNA 后的产物，5端为磷酸基团，3端为羟基。DNase I 活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I 可随机剪切双链 DNA 的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I 可在同一位点剪切 DNA 双链，形成平末端，或 1-2 个核苷酸突出的粘末端。特点：不含 RNase(RNase free)，可以用于各种 RNA 样品的处理。提供了用于DNase I 失活所需的 EDTA。用途：制备不含
13、DNA 的 RNA 样品；RT-PCR 反应前 RNA 样品中去除基因组 DNA 等可能的 DNA 污染；体外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 转录后去除 DNA 模板； DNase I footprinting 研究 DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nick translatioin)；产生DNA 随机片段文库；细胞凋亡 TUNEL 检测中部分剪切基因组 DNA 作为阳性对照。来源：从牛胰腺纯化得到。分子量：约 32kDa(单体)。活性定义：3710 分钟内，将能够完全降解 1g pBR322 质粒 DNA 所需的酶量定义为 1 个活性单位。活性
14、检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgSO4，1mM CaCl2，1g of pBR322 DNA。纯度：不含其它 DNA 内切酶和外切酶，不含 RNA 酶。酶储存溶液：50mM Tris-acetate(pH7.5)，10mM CaCl2，50%(v/v)glycerol。Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl(pH7.5 at 25)，25mM MgCl2，1mM CaCl2。失活或抑制：加入 EDTA 至终浓度为 2.5mM 后，65加热 10 分钟可使 DNase I 失活。酚氯仿抽提也可以使 DNase I 失活。金属离子螯
15、合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，0.1%的 SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM 以上盐浓度均对 DNase I 有显著抑制作用。塞尔托利氏细胞会分泌以下的物质： 抗苗勒管激素（AMH）于胎儿生命的早期就开始分泌。 抑制素及活化素于青春期后分泌，配合调节促滤泡成熟激素（FSH）的分泌。 雄激素结合蛋白促进精子生成及精子成熟。 胶质源性神经营养因子（GDNF）证实是助长精原细胞，以确保精细胞在产期时的自我更新。 Ets 相关分子滋养在成人睾丸精原细胞内的精细胞。 转铁蛋白 1结构编辑塞尔托利氏细胞之间的连接形成了血睾屏障，血睾屏障是一个结构分隔睾丸空隙血液区及精细管内的向管腔区。
16、塞尔托利氏细胞控制养份、激素及其他化合物进出睾丸的细管，且令向管腔区成为高度免疫的位点。它亦负责确立及维持精原细胞的干细胞利基，以确保精子的更新及精原细胞在精子生成的过程中逐步分裂为成熟的生殖细胞，而最终为放出精子。其他在精子生成的成熟阶段，塞尔托利氏细胞会消耗精子没有用的部分。产生细胞一旦塞尔托利氏细胞完全分裂，就不能再增生。所以，一旦启动精子生成，就不会创造更多的塞尔托利氏细胞。一些科学家最近发现在身体以外仍能培育这些细胞。这提供了治疗男性不育缺憾的可能性。命名塞尔托利氏细胞是由发现这种细胞的意大利生理学家塞尔托利（Enrico Sertoli），他是在意大利帕维亚大学研究医药时发现的。
17、2他是于 1862 年在研究医药时用显微镜发现这种细胞。他于 1865 年发表这种细胞的描述，并以“像树的细胞”或“黏性细胞”来形容它。于 1888 年，其他科学家以他的名字来称呼这些细胞。组织学标准的染色法，是很容易将塞尔托利氏细胞与其他生殖上皮细胞混淆。而它最大的分别就是它那深色的细胞核。 3老鼠睾丸细管的横切面病理学支持间质细胞瘤是属于卵巢瘤的性腺基质癌精子发生维基百科，自由的百科全书生精小管与成熟精子（ 苏木精-伊红染色）精子发生（英语：spermatogenesis）是有性生殖的雄性动物的睾丸中，生殖细胞从精原细胞一直发育到成熟的精子的过程。细胞类型 倍性/染色体数量（人类） DNA
18、 拷贝/染色单体数量（人类） Process entered by cell精原细胞(types Ad, Ap and B)倍性 (2N) / 46 2C / 46spermatocytogenesis（有丝分裂）primary 精母细胞倍性 (2N) / 46 2C / 46spermatidogenesis （减数分裂 1 期）2 个次级精母细胞倍性 (N) / 23 2C / 46spermatidogenesis（减数分裂 2 期）4 个精细胞 倍性 (N) / 23 1C / 23 spermiogenesis4 个游动精子 倍性 (N) / 23 1C / 23 spermiati
19、on倍性和染色体计数 are for one cell in G1期, 在 DNA 合成and division 之前一个成熟的人类精子目的繁殖跟动植物一样。位置精子发生过程的位置是男性生殖系统的数个结构。最开始的阶段发生在睾丸，一直到附睾结束。附睾是发展中的精子成熟和储存直到射精的地方。睾丸的生精小管是整个过程的起点，在那里邻近内管壁的干细胞朝着中心分裂从管壁开始，进行到最内层的部分，即 内腔 来生产未成熟的精子。精子成熟过程发生在附睾。阶段精母细胞发生精母细胞发生示意图主条目：精母细胞发生精细胞生成主条目：精细胞生成精细胞生成（spermatidogenesis）是从次级精母细胞生成精细胞
20、（spermatid ）的过程。此过程前已生成的次级精母细胞迅速进入减数分裂 II 期，分裂产生单倍体精细胞。精子形成主条目：精子形成在精子形成（spermiogenesis）阶段中，精细胞开始长出一条尾部。塞尔托利氏细胞的角色睾丸中的塞尔托利氏细胞（红色）和精母细胞（蓝色）。附着于细胞的腔顶点尚未经历 spermination 的精细胞主条目：塞尔托利氏细胞影响因素激素控制精子发生的激素控制随物种而不同。人类精子发生的激素控制机制尚未被完全理解。参考文献The testes and spermatogenesis. University of Wisconsin. 1998 2006-11-
21、27.Johnson, L; Blanchard, TL; Varner, DD; Scrutchfield, WL. Factors affecting spermatogenesis in the stallion. Theriogenology. 1997, 48 (7): 11991216. doi:10.1016/S0093-691X(97)00353-1. PMID 16728209.BARDIN CW: Pituitary-testicular axis. In: YEN SS , JAFFEE RB , eds: Reproductive Endocrinology, 3rd
22、ed. Philadelphia: WB Saunders, 1991CHAMBERS CV , SHAFER MA , ADGER H , et al.: Microflora of the urethra in adolescent boys: relationships to sexual activity and nongonococcal urethritis. J Ped 110:314-321, 1987CZYBA JC , GIROD C: Development of normal testis. In: HAFEZ ESE , ed: Descended and Crypt
23、orchid Testis. The Hague, Martinus Nijhoff, 1980.Whitmore WF, Kars L, Gittes RF: The role of germinal epithelium and spermatogenesis in the privileged survival of intratesticular grafts. J Urol 1985;134:782.DNA 的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤摘要: 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯 DNA 片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持
24、物。DNA 在碱性条件下（pH8 0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同 DNA 分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入 DNA 分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。Westernblot 法即是一种将电泳与 KIJSA 结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定 3 个阶段。Westernblot 法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。1 类型 将电泳与 KIJSA 结合起来的技术 分为电泳、转印、酶免疫测定
25、 3 个阶段用途分析样本组分的免疫学测定方法，是美国斯坦福大学的乔治斯塔克发明的，Western Blot法的名字就由发明者 Southern 与印迹的对象 DNA 相结合得出的 Southern blot。后来又出现了两个过程相似但对象不同的印迹方法，一个针对 RNA，一个针对蛋白质，这两种技术分别被称为 Northern 和 Western，Western Blot 法的叫法最终被确定下来。生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化纸上。生物大分子印迹法始创于 1975 年，内苏格兰爱丁堡大学
26、E.M.Southern 首先提出。他将限制酶切后的 DNA 片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原位凝胶中的 DNA 八片段转移到硝酸纤维素纸上使之固定化。由于这种技术类似用吸干作品上的墨迹，使吸墨纸染上墨迹而被称为印迹法(blotting)。1979 年，Towbin 等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把 Westernblot 法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法(immunoblotting)。对应于 Southern(DNA 分子杂交)、NoHhern(RNA 分子杂交)。1981 年 Burnette 把免疫印迹法称为 Western blottin
27、g 即蛋白质印迹法-Westernblot 法。2 分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。蛋白质分析 W estern 杂交法DNA 分析 Southern 杂交法均是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并均以针对特定氨基酸(Westernblot 法)或核苷酸(Southern 杂交法)序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。蛋白质的探针是抗体，它与附着于固相
28、支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。Westernblot 法的主要优点在于，它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot 法极为有用。由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此溶解、聚集以
29、及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全都无需加以考虑。启动子是 DNA 模板上专一地与 RNA 聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有 2000 个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每 2 秒钟启动一次转录，而弱启动子每 10 分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位（基因编码链上第一个核苷酸） 5侧约 10 和 35 个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需
30、启动子外，还需某些外加序列。启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的去氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被 RNA 聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。完全的启动子称为规范序列。3 启动子元件启动子代表一些重要的元件可以与其他调节区域（如增强子、沉默子、边界元件或绝缘子）合作一致，以主导基因转录的水平。由于启动子一般都是在基因的上游，启动子所在的位置或是转录起始点会由+1 开始编号。上游的位置所以都是由+1 逆数的负数，例如-100 就是位置 100 的上游碱基对。以下是各种启动子：核心启动
31、子是引发转录的必要部份及转录起始点，位置约为-35。且是 RNA 聚合酶的结合位点及一般转录因子结合位点。 近端启动子是基因的近端序列上游，包括一些基本的调控元件，位置约为-250，且是特定转录因子结合位点。 远处启动子是基因的远处序列上游，包括一些额外的调控元件，影响力较近端启动子弱。它是在上游更远的位置（但不是位置性的增强子或调控区域），是特定转录因子结合位点。启动子规范序列的用途一般都是有问题的，且可引致对启动子序列的误解。在规范序列中，转录因子结合位点在特定细胞情况下有一个单独的序列会与蛋白质牢固地结合。但是自然选择会偏向较低能量的结合，作为一种调节转录输出。这种最普遍的序列称为野生型
32、序列。这纵然不是最有利的序列，最近证据显示多种基因（包括原癌基因）都有 G 四股结构作为潜在调控信号。在演化生物学的一个主要问题是修补启动子序列在演化过程中的重要性，例如人类血统从黑猩猩分开后的改变。某些演化生物学家建议启动子的演化或调节区域可能比序列编码更重要。5 侧翼区DNase I 足迹法（footprinting） 方法原理：先将待测双链 DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记,然后加入恰当浓度的DNase,使在 DNA 链上随机形成缺口,经变性后电泳分离,放射自显影,即可形成以相差一个核苷酸为梯度的 DNA 条带。但当 DNA 片段与相应的序列特异性 DNA 结合蛋白结合后
33、,DNA 结合蛋白可保护相应的 DNA 序列不受 DNase的攻击,因而在放射自显影图谱上,DNA 梯度条带在相应于 DNA 结合蛋白的结合区域中断,从而形成一空白区域,恰似蛋白质在 DNA 上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法。如果同时进行 DNA 化学测序,即可判断出结合区的精确顺序。具体操作步骤（举具体的例子）：探针制备及纯化 分别以 BamH(标记 Lower strand)和 Xho(标记 Upper strand)酶切含 104bp 启动子片段的质粒 pEGFP2104,回收纯化后依次加入 5l 10Klenow 缓冲液,2l 115 mmolPLdGTP、dCTP 和 dTTP
34、混合物,2l232 P2dATP,1l 的 Klenow 酶,加水补至 50l 混匀后,37温育 20min,对两个 3粘端补平,并参入同位素进行标记。标记后用Xho和 BamH进行酶切,电泳回收标记后的启动子片段备用.DNase足迹分析样品处理 根据对 A33 表达情况的检测11,本实验以 LoVo 细胞为A33 基因表达的阳性细胞,293 细胞为阴性对照。在 Eppendorf 管中混合下列成分:5l 5结合缓冲液,一端标记的探针(cpm 值为 104),LoVo(分 30g 和 60g 两组)和 293 细胞核蛋白(60g),poly(dI2dC)polydI2dC)1l,用去离子水调至
35、 50l 体积。不加核蛋白的对照组加入 40g BSA。室温放置 30min。加入 5l 10Ca2+PMg2+室温放置 1min。加入适量的 DNase室温作用 1min,立即加入 140l 终止液(012molPL NaCl,20mmolPL EDTA pH 810 ,1% SDS,0125gPL carrier RNA)终止反应。加入 200l Tris 饱和酚：氯仿(11) 抽提一次。将水相转移至另一Eppendorf 管中,加入 500l 无水乙醇于-80沉淀 30min。12000g 离心 10min,弃上清。用75%乙醇漂洗 2 次,干燥后溶于 3l 甲酰胺上样缓冲液中。G+A
36、化学测序反应 在Eppendorf 管中加入一端标记的探针(cpm 值为 105),015gPl 的小牛胸腺 DNA 2l,用TE 将总体积调整至 10l。加入 1l 4%甲酸,37温育 25min。将样品置于冰上冷却,加入150l 1molPL 哌啶,90温育 30min。样品置于冰上 5min,加入 1ml 正丁醇,震荡混匀。高速离心 2min 沉淀 DNA,弃上清。用 150l 1% SDS 溶解沉淀。加入 1ml 正丁醇剧烈震荡,高速离心 2min,去除上清。用 015ml 正丁醇漂洗 2 次,干燥后溶于 10l 上样缓冲液中。电泳及结果分析 将足迹实验样品及 G+A 化学测序样品上
37、6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离。50W 恒功率电泳约 115h 至溴酚蓝前沿到达底端.将凝胶转移至滤纸上,80真空干燥1h。于-80放射自显影 48h。DNase I 足迹试验是一种鉴别 RNA 聚合酶等蛋白质在 DNA 上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性 DNA 结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。DNase I 足迹试验定义蛋白质结合在 DNA 片段上，能保护结合部位不被 DNase 破坏，DNA 分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。DNase I 足迹试验是一种
38、鉴别 RNA 聚合酶等蛋白质在 DNA 上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性 DNA 结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有 DNase I 足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，两者原理基本相同。DNase I 足迹试验的实验流程DNase I 足迹试验的实验流程如下：待检双链 DNA 分子用 P 作末端标记，通常只标记一端；蛋白质与 DNA 混合，等两者结合后，加入适量的 DNase I，消化 DNA 分子，控制酶的用量，使之达到每个 DNA 分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照；从 DNA
39、上除去蛋白质，将变性的 DNA 加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。DNA 甲基化（英语：DNA methylation）为 DNA 化学修饰的一种形式，能在不改变 DNA 序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA 甲基化过程会使甲基添加到 DNA 分子上，例如在胞嘧啶环的 5碳上：这种 5方向的DNA 甲基化方式可见于所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有 1%的 DNA 碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA 甲基化一般发生于 CpG 双核苷酸（CpG dinucleotide
40、）部位；而非 CpG 甲基化则于胚胎干细胞中较为常见。DNA 甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在 DNA 甲基化作用。组蛋白（histones）真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的 1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋 DNA结合成 DNA-组蛋白复合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成 5 类。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质，有六种类型：H1、H2A、H2B、H3、H4 及古细菌组蛋白，它们富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同 DNA 中带负电荷的磷酸基团相互作用转录
41、因子（Transcription factors ，TFs)。真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，转录因子与 RNA 聚合酶形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子,它们与 RNA 聚合酶共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。除 TFD 以外，还发现 TFA，TFF，TFE，TFH 等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些 TF 是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。RNA 的转录
42、合成从化学角度来讲类似于 DNA 的复制，多核苷酸链的合成都是以 53的方向，在 3-OH 末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制（图 17-2）；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且 RNA链的合成是连续的。转录因子(transcription factor)是一群能与基因 5端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。分类真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录机构的一部分往往
43、是通过体外系统看它是否是转录起始所必须的。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类：亚基RNA 聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。复合物某些转录因子能与 RNA 聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的，但亦可能仅是譬如说转录终止所必须的。但是，在这一类因子中，要严格区分开哪些是 RNA 聚合酶的亚基，哪些仅是辅助因子，是很困难的。特异顺序某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。如果这些顺序存在于启动子中，则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些种类的启动子中，则识别这些顺序的因子也只是在这些
44、特异启动子上起始转录必须的。黑腹果蝇的 RNA 聚合酶需要至少两个转录因子方能在体外起始转录。其中一个是 B 因子，它与含 TATA 盒的部位结合。人的因子 TFD 亦和类似的部位结合。同样，CTF(CAAT结合因子)则与腺病毒的主要晚期启动子中与 CAAT 盒同源的部位相结合。结合在上游区的另一个转录因子是 USF(亦称 MLTF)，则可以识别腺病毒晚期启动子中靠近-55 的顺序。转录因子 Sp1 则能和 GC 盒相结合。在 SC40 启动子中有多个 GC 盒，位于-70 到-110 之间。它们均能和 Sp1 相结合。然而含有 GC 盒的不同的 DNA 顺序与 Sp1 的亲和力却各不相同。可
45、见GC 盒两侧的顺序对 Sp1-GC 盒的结合究竟如何能影响转录。有时候需要几个转录因子才能起始转录。例如胞苷激酶的启动子需要 Sp1 与 GC 盒结合和 CTF 与 CAAT 盒结合;腺病毒晚期启动子需要 TFD 与 TATA 盒结合和 USF 与其邻近部位相结合。以上所述的因子是一般转录都需要的，似乎并没有什么调节功能。另一些转录因子则可以调控一组特殊基因的转录。热休克基因就是一个很好的例子。真核生物的热休克基因在转录起始点的上游 15bp 处有一个共同顺序。HSTF 因子仅在热休克细胞中有活性。它与包括热休克共同顺序在内的一段DNA 相结合，所以这个因子的激活可以引起约包括 20 个基因
46、的一组基因起始转录。在这里，转录因子和 RNA 聚合酶之间关系很类似细菌的 因子与核心酶之间的关系。转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。特异型转录因子，能够选择性调控某种或某些基因的转录表达。典型的转录因子含有 DNA 结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。这些功能区域决定转录因子的功能和特性 (Liu et al., 1999)。DNA 结合
47、区带共性的结构主要有：1）HTH 和 HLH 结构：由两段 -螺旋夹一段 -折叠构成，-螺旋与 -折叠之间通过 -转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2）锌指结构：多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+ ，其余约 12-13 个残基则呈指样突出，刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关。由两段 - 螺旋平行排列构成，其 - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而
48、呈拉链状，两条肽链呈钳状与 DNA 相结合。转录调控区同一家族的转录因子之间的区别主要在转录调控区。转录调控区包括转录激活区 (transcription activation domain) 和转录抑制区 (transcription repression domain) 二种。近年来，转录的激活区被深入研究。它们一般包含 DNA 结合区之外的 30-100 个氨基酸残基，有时一个转录因子包含不止一个转录激活区。如控制植物储藏蛋白基因表达的VP1 和 PvALF 转录因子，它们的 N-末端酸性氨基酸保守序列都具有转录激活能力，与酵母转录因子 GCN4 和病毒转录因子的 VP16 的酸性氨基酸
49、转录激活区有较高同源性 (Bobb et al., 1996)。典型的植物转录因子激活区一般富含酸性氨基酸、脯氨酸或谷氨酰胺等，如GBF (G-box binding factor) 含有的 GCB 盒 (GBF conserved box) 激活结构域(lunwen114 and Bevan, 1998)。转录抑制区也是转录因子调控表达的重要位点，但是对其作用机理研究尚不深入。可能的作用方式有三种：1）与启动子的调控位点结合，阻止其它转录因子的结合；2）作用于其它转录因子，抑制其它因子的作用；3）通过改变 DNA 的高级结构阻止转录的发生。转录因子必须在核内作用，才能起到调控表达的目的。因此，转录因子上的核定位序列是其重要的组成部分。一般一个或多个核定位序列在转录因子中不规则分布，同时也存在不含核定位序列的转录因子，它们通过结合到其它转录因子上进入细胞核。核定位序列一般是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的区段。目前，水稻中的 GT-2、西红柿中的HS
