1、毕 业 论 文（设计）题 目 用 HPLC 法同时测定配制酒中四种芳香物质方法研究 指导老师 张 波 专业班级 食品营养与检测 112 姓 名 王秀云 学 号 20117100238 2014 年 5 月 28 日浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)I摘要：本文建立了同时检测配制酒中 -苯乙醇、苯乙酮、丁香醇、肉桂醇共 4 种芳香物质的高效液相色谱（HPLC）分析方法。样品经稀释后用固相萃取柱净化后，用 5ml 水清洗，5ml 甲醇洗脱。采用 Zobax SB-C18 色谱柱(4.6 mm150 mm，5 m)，以甲醇和水作为流动相，梯度洗脱。各目标组分回收率在 91.4 %105.6 %之间
2、，相对标准偏差为 0.3 %2.1 %。该方法快速、简便、灵敏、结果准确可用于配制酒中 4 种芳香物质的同时检测。关键词：芳香物质；快速；简便；检测浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)II目 录引言 11 材料与仪器 21.1 实验材料 .21.2 实验仪器 21.3 实验试剂 22.实验方法 .22.1 色谱条件 .22.2 样品前处理 .33 结果与分析 33.1 色谱条件的优化 .33.2 固相萃取条件的优化 43.2.1 不同固相萃取柱效果的比较 53.2.2 洗脱液的选择 53.3 线性范围及检出限 53.4 回收率和精密度 63.5 实际样品测定 .9结论 9参考文献 10浙江经贸
3、职业技术学院毕业论文（设计)第 1 页引言酒是人类生活中的主要饮料之一。中国酿酒历史源远流长，品种繁多，名酒荟萃，享誉中外。黄酒是世界上最古老的酒类之一，约在三千多年前，商周时代，中国人独创酒曲复式发酵法，开始大量酿制黄酒。约一千年前的宋代，中国人发明了蒸馏法，从此，白酒成为中国人饮用的主要酒类 1。配制酒又称调制酒。它的诞生晚于其他单一酒品，但是发展很快，配制酒主要有两种配制工艺，一种是在酒和酒之间进行勾兑配制，另一种是以酒和非酒精物质进行勾调配制 2。酒中的芳香物质是反映酒类品质好坏的重要因素之一。酒中的芳香物质大约有三百多种。分别归属于醇类、酯类、有机酸、羰基化合物、酚类、萜烯类化合物等
4、 3。酒的风味跟芳香物质有很大的联系，酒中芳香物质越多，酒的风味就越浓厚。酒中的芳香物质, 对酒的优劣、质量评价系统的建立及酿酒工艺实施具有重要的理论与实践意义。目前国标方法中酒类中芳香物质的分析大多采用气相色谱法，如 GB/T 10345白酒分析方法和GB/T 13662黄酒中都采用气相内标法测定，此方法要用到白酒分析专用柱，成本较高，周期长，干扰大，重现性差，回收率低并且需要准确地加入内标物，其他分析酒的毛细管柱中难以找到成分相似、相近出峰的内标物。而采用气相外标法往往采用热柱头分流进样法，容易引起样品的热分解和歧视现象，导致检测结果误差波动较大 4,5。相比较气相色谱法，高效液相色谱法分
5、析速度快且重现性好，不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在室温下分析即可，不需高柱温。目前有关使用 HPLC 测定酒类产品中芳香物质的研究较少 6。但是此类方法只对单一的芳香物质含量做了分析讨论或者只针对一类产品，而用高效液相色谱同时测定酒类中多种芳香物质的方法尚未有报道 7。如何来分析酒中的芳香物质就显得尤为重要。本研究以-苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛四种芳香物质为研究对象，探索一种快速、简便、灵敏、准确的酒类中芳香物质含量的检测方法。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 2 页1材料与仪器1.1实验材料从市场上随机选择 3
6、种配制酒.1.2实验仪器Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（Agilent 公司） ；固相萃取柱：Oasis HLB cartridge (3 cc，60 mg Waters 公司 )。液相色谱柱：Agilent SB-C 18 柱(4.6 mm150 mm，5 m，Agilent 公司)；氮吹仪:HGC-36A，(天津市恒奥科技发展有限公司）分析天平：AL204-IC 。(Mettler Toledo 公司)1.3实验试剂标准物质：-苯乙醇(99%)、苯乙酮(99%)、丁香醛(99%)、肉桂醛(99%)（Sigma-Aldrich 公司） ，甲醇为色
7、谱纯（Merck 公司） ；实验用水为 Milli-Q 超纯水；标准溶液的配制：分别准确称取 -苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛 100 mg 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成 1.0 mg/mL 的储备液，密封储存于 4 冰箱中；再准确吸取 1.0 mg/mL 的标准储备液 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容得 100 g/mL 的中间标准溶液。用流动相将中间标准溶液稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。2.实验方法2.1色谱条件液相色谱柱：Agilent SB-C 18 柱(4.6 mm150 mm，5 m，Agilent 公司)；柱温:40 ；进样量 20 L；流动相
8、：甲醇水梯度洗脱，流动相如 表 2.1 所示，流速 1.0 mL/min。检测波长：-苯乙醇 ：210 nm 、苯乙酮：245 nm、丁香醛、肉桂醛： 298 nm。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 3 页表 2.1 流动相梯度时间（min）水（ %）甲醇,（%）0.0 80.0 20.04.0 80.0 20.017.0 40.0 60.021.0 20.0 80.021.2 80.0 20.02.2样品前处理准确移取 10 mL 配制酒样品加纯水稀释，使其酒精度小于 12 %vol。HLB 固相萃取柱用 3 mL 甲醇，3 mL 水活化，完全转移稀释后的样品过固相萃取柱，保持 1 滴
9、/秒的流速。样品通过固相萃取柱净化后，用 5 mL 水清洗后慢慢排干水分，5 mL 甲醇洗脱，40 氮气吹至近 1mL，用水定容至 2 mL，0.22 m 滤膜过滤，待测。3结果与分析3.1色谱条件的优化流动相梯度选择：在不影响分离效果的前提下, 为提高分离效率, 采用梯度洗脱。考察了甲醇比例在 20%80%时的洗脱状况, 确定了洗脱梯度(见表 2.1)。检测波长：将 4 种芳香物质在 190 nm350 nm 作紫外光谱扫描， 得到各物质的最大吸收波长：- 苯乙醇为 210 nm、苯乙酮 244 nm、丁香醛 310 nm、肉桂醛 291 nm。试验检测波长为 210 nm、245 nm 和
10、 298 nm 时各物质的响应情况，各物质的响应均很高，故将检测波长定为 210 nm、245 nm 和 298 nm。4 种物质的光谱图如图 3.1 所示。不同色谱柱分离效果的比较：本实验选择了 3 根 C18 色谱柱，在不同的色谱分离条件下对相同的样品进行分析，比较分析结果，最终发现用 Agilent SB-C18(4.6 mm150 mm，5 m)的分离效果最好。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 4 页图3.1 四种芳香物质的光谱图: 1.- 苯乙醇 2.苯乙酮 3.丁香醛 4.肉桂醛3.2固相萃取条件的优化配制酒的酒精度通常为 12% vol52% vol，由于酒精度可能会影响目
11、标物在柱子上的萃取效率，因此实验首先考察不同的酒精度对固相萃取效率的影响。实验采用 Oasis HLB cartridge (3mL，60 mg )柱，对不同酒精度（ 12% vol, 15% vol, 22% vol, 28% vol, 32% vol, 38% vol, 42% vol, 48% vol, 52% vol）10 mL 的溶液(加标浓度 2 mg/L)进行固相萃取实验，对流出液进行分段收集，检测最后 1mL 流出液是否含有目标物。结果表明，酒精度小于等于 15 %vol 的测试液，流出液未检出目标物，说明此时目标物在固相萃取柱上的保留为 100 %。选择 12% vol 和
12、15% vol，两种不同酒精度标准液模拟测试各目标物在 HLB 萃取柱上的最大保留体积。用加标溶液(2mg/L)进行测试， 接取分段流出液上机检测。12% vol和 15% vol 的标准液 过柱后检测到 目标物时的体积分别为 80 mL 和 70 mL。结果表明，随着酒精度的增加，检测目标物越早，说明酒精度越高对目标物的洗脱作用越强，综合考虑采用 12%的乙醇溶液进行后续实验，对实际样品中酒精度大于 12 %的样品采用加入一定比例的纯水稀释的方法达到 12 %。3.2.1 不同固相萃取柱效果的比较本实验考查了五款固相萃取柱：Waters Oasis HLB cartridge (3mL/60
13、 mg )、Waters Oasis MCX cartridge (3mL/60 mg )、Waters C18(3mL/60 mg )、Agela Cleanert PWAX 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 5 页(3mL/60 mg )、Agela Cleanert PCX (3mL/60 mg )对各目标物的保留情况。将 10 mL 溶液加标 2 mg/L 的 12 %乙醇水过柱，5 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近 1mL，用水定容至 2mL，上机测得回收率如表 3.1。表3.1不同固相萃取柱回收率固相萃取柱 -苯乙醇, % 苯乙酮,% 丁香醛,% 肉桂醛,%Waters
14、 Oasis HLB 93.1 98.8 99.2 101.4Waters Oasis MCX 60.3 73.6 78.8 92.8Waters C18 11.3 19.4 13.0 33.8Agela Cleanert PWAX 31.3 72.9 69.7 68.5Agela Cleanert PCX 52.6 72.3 74.5 90.9通过上表的数据可以看出，Waters Oasis HLB 柱的回收率最高，故本实验选择该柱对样品进行净化浓缩。3.2.2 洗脱液的选择将 10 mL 溶液加标 2 mg/L 的 12 %乙醇水，过 Oasis HLB cartridge (3mL/60
15、 mg )柱，分别用 5 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用水定容至 2 mL，上机。结果表明，5 mL 甲醇能完全洗脱吸附在 HLB 柱上的目标物，故选其作为洗脱剂。3.3线性范围及检出限对四种物质的标准液进行检测，以仪器响应的峰面积Y 对应浓度X 进行线性回归，得到各物质的标准曲线方程、线性范围和相关系数。各物质在相应浓度范围内的线性良好，结果列于表3.2。采用空白样品处理液加标，以S/N=3 计算方法的检出限，以S/N=10 计算方法的定量限，再折算样品的检测限和定量限。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 6 页图3.2 四种芳香物质的标准曲线图: 1.-苯乙醇 2.苯乙酮
16、 3.丁香醛 4.肉桂醛表3.2 线性回归方程物质 曲线方程 相关系数 R 检出限(mg/L) 定量限(mg/L)-苯乙醇 y = 57.74x - 1.1196 0.9998 0.02 0.06苯乙酮 y = 115.68x - 4.8068 0.9999 0.02 0.06丁香醛 y = 151.04x - 12.9972 0.9998 0.02 0.06肉桂醛 y = 221.15x - 14.8730 0.9998 0.01 0.033.4回收率和精密度用优化后的处理方法对已知不含上述四种目标物的配制酒进行3种浓度的混标的加标回收实验, 3次平行测定( n = 3)的平均回收率和RSD
17、 结果如表3.3所示。由表中数据可知, 各物质的回收率范围在87.0 %105.6 % , RSD范围在0.3 % 2.1 % , 说明本方法满足定量分析的要求。标样谱图、加标谱图、空白谱图如图3.3所示。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 7 页表3.3 配制酒中加标回收实验物质 本底值(mg/L) 加入量(mg/L) 加标后测定 值(mg/L) 回收率( %) RSD(%)0 0.20 0.197 98.5 0.70 1.00 1.021 102.1 0.4-苯乙醇0 5.00 5.178 103.6 0.30 0.20 0.183 91.5 2.10 1.00 0.914 91.4
18、1.9苯乙酮0 5.00 4.658 93.2 0.90 0.20 0.185 92.5 0.80 1.00 0.948 94.8 1.2丁香醛0 5.00 4.671 93.4 1.50 0.10 0.104 104.0 0.80 0.50 0.528 105.6 0.8肉桂醛0 2.50 2.632 105.3 1.2浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 8 页图3.3 四种芳香物质的高效液相色谱图:(A) 标准样品;(B) 加标样品; (C) 空白样品1.丁香醛 2.-苯乙醇 3.苯乙酮 4.肉桂醛3.5实际样品测定采用本方法对市售 3 份配制酒样品进行检测，结果见表 3.5。浙江经贸
19、职业技术学院毕业论文（设计)第 9 页表3.5 配制酒中各芳香物质测定结果 (mg/L)样品 -苯乙醇 苯乙酮 丁香醛 肉桂醛1 35.80 0 0 02 28.34 0 0 84.323 32.18 0 0 0通过检测可知高效液相色谱（HPLC）分析方法快速、简便、灵敏结果准确可用于配制酒中 4 种芳香物质的检测。结论建立了高效液相色谱法同时测定配制酒中 4 种常见芳香物质（-苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛）。样品稀释后，用 HLB 固相柱萃取净化，甲醇洗脱。采用 Zobax SB-C18 色谱柱 (4.6 mm150 mm，5 m)，以甲醇和水作为流动相，梯度洗脱。各目标组分回收率在 91
20、.4 %-105.6 %之间，相对标准偏差为 0.3 % - 2.1 %。该方法适用于配制酒中 4 种芳香物质的检测方法。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计)第 10 页参考文献1 赵东, 李阳华 , 向双全等. 气相色谱一质谱法测定酒糟、白酒中的芳香族香味成分J. 酿酒科技, 2006(10): 9294 .2 张赛群, 陈艺, 裘璐等. 金门高梁酒中的芳香性成分的 GC-MS 分析J. 数理医药学杂志, 2010, 23(6): 689690 .3 高敏, 曾新安, 肖利民等. 青梅酒中苯甲醛含量的测定J . 酿酒科技, 2009(5): 110112.4 陈青俊 , 丁献荣, 汪庆旗等. 高效液相色谱 -二极管阵列检测法测定黄酒中 -苯乙醇的含量J. 食品与发酵工业, 2004(3): 9496. 5 刘东亚, 金征字. RP-HPLC 法测定发酵液中 -苯乙醇的研究J. 食品工业科技， 2006(1) : 198200.6 林玲, 王丽, 张兴亚. 黄酒陈酿过程中主要成分变化的研究J. 中国酿造, 2011(5): 165-170.7 王贞强 , 马波, 迟建. 黑叶荔枝鲜果汁与发酵酒液的香气成分及其变化J . 中国农学通报, 2006, 22(8): 135-138.
