1、各位老师同学们大家好啊！（鼓掌哇）,讲课目标：更全面的学习植物生理知识，更透彻的学习植物生理网 上教学。 讲课人：王磊,植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性,介绍叶绿体中 H2O2的产生和清除，抗坏血酸过氧化物酶(APX)的酶学和分子特性，APX 同工酶在植物体内的分布和功能及其相互之间的区别，APX 与细胞色素 C 过氧化酶(CPX)和谷胱苷肽过氧化物酶(GPX)等一些在不同生物中的 清除酶的异同之处，以及有关 APX 基因工程的研究进展。 关键词:抗坏血酸过氧化物酶(APX); H2O2清除；叶绿体,过氧化酶的作用机制,过氧化氢h2o2)是一种活性氧，若不及时清除，它会通过金属
2、催化的Haber-Weiss反应生成高度活泼的羟基基(OH)。OH 能氧化几乎所有的细胞组分，并引起细胞的破坏。因此，对所有的好氧生化过程，及时清除H2O2 和有机过氧化氢物质对于维持植物正常的生理功能很重要。抗 坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)是利用抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)为电子供体的2O2的清除剂。在细胞内它的同工酶定位于4 个不同的区域：叶绿体中的基质APX(sAPX)、类囊体膜APX(tAPX)、微体APX(mbAPX)和胞质APX(cAPX)。目前，有多种植物的APX 基因已克隆并应用于提高植物的抗逆性,叶绿体中H2O2的产生
3、和清除及APX的作用机制H2O2是叶绿体中光合电子传递和某些酶学反应的天然产物及对植物具有毒害作用的一种活性氧。活性氧是需氧生物正常代谢的产物，已知在逆境伤害、机体损伤、细胞分裂、酶反应等方面都可能涉及到活性氧的作用。活性氧可与D N A 、类脂化合物和蛋白质反应，引起细胞损伤。在植物组织中，活性氧类型主要有 H2O2、OH、单线态氧(O2)等。H2O2的伤害机制，一方 面与其本身的毒害有关，如它可以抑制Calvin循 环中的酶，降低叶绿体中的AsA 含量，氧化铁氧 还素2 。H2O2的累积可以促进叶绿素的降解，其原因可能是由于高水平的H2O2诱导酚特异性过氧化物酶(PPOD)的从头合成，而P
4、POD 使酚氧,成酚自由基从而攻击叶绿3所致。另一方面，H2O2与超氧阴离子自由基(O2 相互反应形成致命的OH。已证明OH 是活性最强的活性氧，它可以直接引发脂质过氧化4，严重时导致植物细胞死亡。一般认为，叶绿体中双氧分子的光还原产物是H2O2，它由定位在基质中的铜锌- 超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)催化的O2的歧化反应产生5:O2 +2H+H2O2+O2在光照下的叶绿体中，双氧分子是由光系统(PS)(反应中心X和/或反应中心A/B还原侧电子载体和铁氧还蛋白还原而成的6，其光还原速率15 molmg(chl)h-1仅是饱和光下由CO2的同化速率所观察到的电子传递速率的 10%，其原因尚不
5、清楚7。H2O2攻击的主要目标是果糖-1,6-二磷酸酶、3- 磷酸甘油醛脱氢酶和 5- 磷酸核酮糖激酶，因此及时清除H2O2对于维持叶绿体的光合能力是必要的1。,核黄素和还原性核黄素的相互转化,APX的反应机制,APX 的反应机制Foyer和Hailiwell11于1976年发现了以AsA为电子供体的一种过氧化物酶，1981 年Nakano 和Asada2正式确定此酶为APX，存在叶绿体的基质 中 。2.1 APX的反应机制 APX的催化循环属于过氧化物酶的乒乓机制，反应如下12(R表示卟啉或保守Trp基，MDA 为单脱氢抗坏血酸):APXFe (III)-R+H2O2APX-Fe(IV)O-
6、R+H2OAPX-Fe(IV)O-R+AsA APX-Fe(IV)O-R+MDAAPX-Fe(IV)O-R+AsA APX-Fe(III)-R+MDA+H2OAPX 首先被H2O2氧化成中间复合物，此种中间复合物接着氧化抗坏血酸双电子氧化物形成2个分子的 M D A。当 A s A 未为复合物利用时，A P X失 活 。,抑制剂和抗坏血酸的作用,或中间复合物发生反应，从而使 A P X 失活。HU+APX(或复合物)失活的APX当AsA 存在时，HU 的酶促产物与AsA 竞争，HU 被AsA 产生的MDA 所捕捉。通过这个机制，AsA保护了由自杀性抑制剂引起的APX的失活13。AsA 的浓度低
7、于20 molL-1时，APX 即失活，这主要是由中间复合物的降解引起的。AsA 未被间复合物利用时，APX 的血红素就会被H2O2分解掉，从而使APX 失活。 tAPX 和sAPX 的半寿期约是20 s，而cAPX 的半寿期约是10 min，所以叶绿体APX 非常不稳定9，这也是APX 不像谷胱甘肽过氧化酶(glutathioneperoxidase,GPX)那样容易被发现的原因之一。AsA 可直接与活性氧反应而将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中起作用，即在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与APX 介导的H22的清除。在这一过程中，AsA 氧化成抑制剂及抗坏血酸的作用 APX作为一种
8、血红蛋白，通过与血红素铁的连接作用而受氰化物或叠氮化物抑制。巯基试剂也能通过阻断H2O2与血红素的氧化作用而使 APX 失活。APX 还有更多的特异性抑制剂，如巯基、双胺苯、羟基脲素和羟胺。这些化合物本身并不能抑制APX，但在H2O2存在时，它们则使APX 失活。例由APX 催化的羟脲(HU)能被H2O2氧化形成它的氨基离子(HU)，尽管它的反应速度与抗坏血酸相比并不高。2HU+H2O22HU+2H2O2反应中心形成的HU与APX MDA。叶绿体中APX 发挥正常的催化作用时，需要依赖单二氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbatereductase, MDHAR)、二氢抗坏血酸
9、还原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)、铁氧还蛋白(ferredoxin, Fd)和MDA等参与的4种反应源源不断地再生AsA。如AsA 由MDHAR14,15或DHAR14分别利用NAD(P)H或谷胱甘肽(glutathione, GSH)作为电子供体，催化过氧化物酶反应中的氧化产物得以再生，而这两种电子供体又可利用来自类囊体的电子再生10。由于AsA在清除活性氧的过程中发挥作用，故在叶绿体中，它与氧的摄入、APX 的功能及分子氧还原相关的过程统称为“米勒-抗坏血酸过氧化物酶光呼吸”16。因为AsA能使APX处于稳定状态17，所以在纯化过程中必须,AXP的
10、分子和酶学特性,蛋白，通过与血红素铁的连接作用而受氰化物或叠氮化物抑制。巯基试剂也能通过阻断H2O2与血红素的氧化作用而使 APX 失活。APX 还有更多的特异性抑制剂，如巯基、双胺苯、羟基脲素和羟胺。这些化合物本身并不能抑制APX，但在H2O2存在时，它们则使APX 失活。例如，由APX 催化的羟脲(HU)能被H2O2氧化形成它的氨基离子(HU)，尽管它的反应速度与抗坏血酸相比并不高。2HU+H2O22HU+2H2O2反应中心形成的HU能与APX 或中间复合物发从HU+APX(或复合物)失活的APX当AsA 存在时，HU 的酶促产物与AsA 竞争，HU 被AsA 产生的MDA 所捕捉。通过这
11、个机制，AsA保护了由自杀制剂引起的APX的失活13。AsA 的浓度低于20 molL-1时，APX 即失活，这主要是由中间复合物的降解引起的。AsA 未被中间复合物利用时，APX 的血红素就会被H2O2分解掉，从而使APX 失活。 tAPX 和sAPX 的半寿期约是20 s，而cAPX 的半寿期约是10 min，所以叶绿体APX 非常不稳定9，这也是APX 像谷胱甘肽过氧化酶(glutathioneperoxidase,GPX)那样容易被发现的原因之一。AsA 可直接与活性氧反应而将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过中起作用，即在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与APX 介导的H2O2的清
12、除。在这一过程中，AsA 氧化成MDA。叶绿体中APX 发挥正常的催化作用时，需要依单二氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbatereductase, MDHAR)、二氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)、铁氧还蛋白(ferredoxin, Fd)和MDA等参与的4种反应源源不断地再生AsA。如AsA 由MDHAR14,15或DHAR14分别利用NAD(P)H或谷胱甘肽(glutathione, GSH)作为电子供体，催化过氧化物酶反应中的氧化产物得以再生，而这两种电子供体又可利用来自类囊体的电子再生10。由于AsA在清除活性氧的
13、过程中发挥作用，故在叶绿体中，它与氧的摄入、APX 的功能及分子氧还原相关的过程统称为“米勒-抗坏血酸过氧化物酶光呼吸”16。因为AsA能使APX处于稳定状态17，所以在纯化过程中必须,CAXP,CHLAXP异同 两种类型的酶分子是不同的，各有其特征性序列。目前，在 c A P X 所测序列中，半胱氨酸(Cys)-31被保护起来，表明它参与了过氧化反应，而在tAPX 中未发现相应的Cys 残基。 分子量不同，chlAPX 为30 00034 000 bp，cAPX约为57 500 bp。 对AsA的敏感性不同，在不含有AsA 的介质中，chlAPX比cAPX更快失活，前者的半衰期为1530 s
14、，后者约为300 s。 对抑制剂的敏感性不同，chlAPX对巯基试剂(羟基脲)、氨基苯酚等比cAPX更敏感。,chlAPX 对电子供体的特异性更高，它不能以愈创木酚、邻联二茴香胺、邻苯二酚作为电子供体；而cAPX则可以。 种cAPX 形式，有几种cAPX 以同二聚体形式存在，目前已知序列的 cAPX 未发现目标转运肽；chlAPX 以单体存在，tAPX 和sAPX 都发现了向叶绿体转移的转运肽。 最适pH 值范围不同，chlAPX 的最适pH 值范围窄于cAPX。,AXP基因工程,提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途径之一。APX 能提高氧化耐受性的作用已在许
15、多植物中有报道，目前多种植物的APX 基因已克隆并应用于植物转基因的研究。人们已从棉花、拟南芥等植物中克隆了APX基 因 ，并 进 行 了 部 分 转 基 因 植 物 的 研 究 。Kornyeyev等34获得了转叶绿体APX基因的棉花植株，A P X 在植物体内过量表达，其叶片中 A P X活性比野生型的提高5倍。王庆斌等35获得了转APX 基因的水稻植株并研究了其功能，发现APX基因植株中可能表达APX 的相关蛋白，可以抵抗甲 基 紫 精 的 氧 化 胁 迫 ，有 效 保 护 膜 系 统 。Kornyeyev 等34将SOD、tAPX、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)基因分别导入棉花中，得到过量表达，所有转基因棉花具有较高的PSII光化学活性和抗氧化能力。Wang 等36获得的转tAPX 烟草植株，其APX 活性明显提高，抗低温的能力也增强。Charles等20研究大豆cAPXs中观察到，APX 的转录、翻译和翻译后调控可能增强农作物抵抗环境胁迫的能力,结束语,有什么您不满意的地方，请海涵！ 您热情的鼓掌预示您考研的成功，雷鸣般的掌声，嗨起来,谢谢观看,
