1、1绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011 预防医学（卫生检验检疫） 摘 要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。 方法：从 E.coli DH5 中用碱提取质粒的方法提取质粒 pEGFP-N3 和质粒 pET-28a。然后用质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶 BamHI 和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了 GFP 基因。将含有 GFP 基
2、因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21 中，用LB 培养基对转化后的 E.coli 进行扩大培养。用 IPTG 诱导 GFP 基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。 结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。关键词：绿色荧光蛋白 基因克隆 重组表达 转化 粗提取2目录1 前言 .32 实验目的 .43 实验设备 .44 材料及试剂 .55 实验操作步骤 .55.1 操作流程 55.2 质粒 DNA 的分离与纯化 65.2.1 质粒的培养 .65.2.2 质粒的 DNA 的碱提取法 .65.2.3 质粒 DNA 的鉴定与纯化 .
3、75.3 酶切及连接 85.3.1 双酶切 .85.3.2 回收酶切产物（采用 DNA 回收试剂盒进行回收） .85.3.3 连接 .95.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 .935.4.1 LB（ Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） .95.4.2感受态细胞的制备 (CaCl2 法 )95.4.3 转化涂板 .105.5 GFP 蛋白的诱导表达 .105.6 绿色荧光蛋白的粗提取 11参 考 文 献 .11附 录 121 LB 培养基的配制： 122. 溶液 123. 溶液 124. 溶液（100ML） .125. DNASE-FREE RNASE A136.T
4、E 缓冲液（PH8.0） 137. 20TBE .138. GENEFINDER-溴酚蓝上样缓冲液 .139PEGFP-N 3 质粒全图谱 .1310PET-28 A 质粒全图谱 1441 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP) 1
5、 GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于荧光强度高，稳定性高；GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域 23 。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调
6、控和分子机制提供了一种简洁有效的手段 4、5 。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术 6 。质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤 7，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态细胞的制备主要采用CaCl 2 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca 2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入 8。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转
7、化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点 9。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统10。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要5菌株 11。随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有 T7启动子、Trp 启动子-色氨酸启动子、Tac 启动子、T
8、7噬菌体中基因10 的启动子及 Lac启动子等。Lac 启动子受分解代谢系统活化蛋白和 cAMP 的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物 IPTG 可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。根据原核生物基因表达特点选择载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质 12。研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒 pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切及用 IPTG 诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功
9、诱导表达。2 实验目的学会绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达整个过程中的每一步，掌握其方法。本实验是通过基因工程手段对目的基因 EGFP 进行克隆，并进行 EGFP 表达载体的构建，并在大肠杆菌中诱导表达，获得 GFP 蛋白。 学会最常用的小量制备质粒 DNA 的碱裂解方法 学会常用的 DNA 琼脂糖凝胶电泳技术学会用限制性内切酶切割 DNA学会用琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段学会 DNA 片段的体外连接技术学会用 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞学会用质粒 DNA 转化感受态受体菌的基本操作技术6学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌了解外源基因在原核细胞中表达的特点和
10、IPTG 诱导表达的方法学习 SDS-PAGE 胶的基本灌制方法和用 SDS-PAGE 检测表达蛋白3 实验设备恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪，水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫外灯。4 材料及试剂BamH I；NotI(10U/L)；T4 ligase；LB 培养基；溶液；溶液；溶液；TE 缓冲液；20TBE；GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液。5 实验操作步骤5.1 操作流程质粒 提取 质粒 提取酶切 回收 酶切 回收E.coliDH-5（pET-28）E.coliDH-
11、5（pEGFPN3）质粒 pEGFPN3 质粒 pET-28载体片段插入片段7连 接转 化诱 导图一 流程图5.2 质粒 DNA 的分离与纯化5.2.1 质粒的培养1）在含有 pEGFPN3 质粒的 DH5 平板上菌落上挑取菌种，置于含有 5mL LB 培养基的试管中。摇晃过夜。 2）有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。5.2.2 质粒的 DNA 的碱提取法1）取 1.5ml DH5 培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（微量离心管）中, 13000rpm 离心1min。重组质粒(pET-28-GFP)BL-21(pET-28-GFP)绿色荧
12、光蛋白（粗提取）82）重复 1。3）弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 4）菌体沉淀重悬浮于 100L 溶液中(需剧烈振荡),室温下放置 10min。 5）加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管 5 次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴 5min。 6）加入 150L 预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 3 次,使沉淀混匀,冰浴中 15 分钟,13000rpm 离心 5min。 7）上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm 离心 2min。 8）将水相移入干净 epp
13、endorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm 离心 2min。 9）将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下 2min，然后 13000rpm 离心 5min。 10）弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，13000rpm 离心 5min。 11）吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。 12）将沉淀溶于 30L TE 缓冲液(pH8.0，含 20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。13）按照同样的流程和方法将 pET-2
14、8a 的质粒也提出来，保存在-20冰箱中。5.2.3 质粒 DNA 的鉴定与纯化1) 1%琼脂糖凝胶的配制加 20ml 1TBE 缓冲液于三角瓶中，9精确称取 0.2g 琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，冷却至 60左右，2) 琼脂糖凝胶电泳轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却 30 分钟以上，将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，取 5l 质粒 DNA 及 2l GeneFinder 混匀上样50-100v 约电泳 0.5-1 小时蓝盾可见光透射仪观察结果。3) 回收产物用干净的刀片将需要的 DNA 条带从凝胶上
15、切下来，称取重量。以 0.1g 凝胶对应 300L 的体积加入 PN。50水浴放置 10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm 离心60s，弃掉废液。加入 800L 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。加入 500L 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。将离心吸附柱放回收集管，13000rpm 离心 2min。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30L，洗脱缓冲液先在 65水浴预热，室温放置 2min，13000rpm 离心 1m
16、in，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm 离心 1min。10置于20保存。5.3 酶切及连接5.3.1 双酶切按如下双酶切体系（30L）混合:表 1 双酶切体系的配制反应物（L） pEGFP-N3 pET-28a 质粒 18 18 BamH I 2 2 Not I 2 2 10buffer K 3 3 0.1%BSA 缓冲液 3 3 灭菌双蒸水至 30ul 体系1) 离心 10s，混匀。2) 37水浴酶切 3-4h。3) 配制 1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶 30ml。4) 适当放置冷却，45左右倒于电泳胶板上，插好梳子。5) 待凝胶凝固好以后，拨下梳子。6) 酶切样品
17、中加入 5l 溴酚蓝-GeneFinder 混合液混匀，上样。7) 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳 30min。8) 荧光激发器观察质粒 DNA 条带的酶切情况，并照像。115.3.2 回收酶切产物（采用 DNA 回收试剂盒进行回收） 1) 配 30mL 1进口琼脂糖凝胶，尽量长一些（用粗梳子） ，对酶切产物进行电泳分离；2) 将酶切产物全部加入加样孔中 3) 跑胶，观察结果，并且拍照。 4) 用干净的刀片将需要的 DNA 条带从凝胶上切下来，称取重量。 5) 以 0.1g 凝胶对应 300L 的体积加入 PN。 6) 50水浴放置 10min，期间不断温和上下翻动离心
18、管至胶完全融解。 7) 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm 离心60s，弃掉废液。8) 加入 800L 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。9) 加入 500L 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。 10) 将离心吸附柱放回收集管，13000rpm 离心 2min。 11) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30L，洗脱缓冲液先在 65水浴预热，室温放置 2min，13000rpm 离心 1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm 离心 1min。
19、12) 置于20保存。 5.3.3 连接按照连接体系进行，16连接过夜。表 2 连接体系反应物 体积/L 12回收纯化的 pET-28a 质粒 5gfp 基因片段 12 T4 连接酶 1 缓冲液（10） 2 5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应使培养基降温至 60左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。75mm 直径的培养皿约需 15ml 培养基。5.4.2感受态细胞的制备 (CaCl2 法) 1) 挑一大肠
20、杆菌单菌落放入 3ml LB 液体培养基（含 Kan+） ，37培养过夜。2) 活化大肠杆菌：取 3ml 新鲜的 LB 液体培养基加入 50-150l 的过夜菌，培养 2-3 个小时。3) 将昨夜摇出来的 DH5 或 BL21 培养液转入离心管中,冰上放置 10min,然后于 4下4000rpm 离心 5min。 4) 弃去上清,用预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2溶液 600L 轻轻悬浮细胞,冰上放置 20min, 4下 4000rpm 离心 5min。 5) 弃去上清,加入 300L 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，
21、可-80长期保存。5.4.3 转化涂板 1) 取 2 个无菌离心管，分别加入 100L BL21 感受态细胞悬液，第 1 管加 5l 无菌水，13第 2 管加入质粒 DNA 溶液 5l,轻轻摇匀,冰上放置 30min。2) 42水浴中热激 90s,热激后迅速置于冰上冷却 5min。 3) 分别向管中加入 100L LB 液体培养基,混匀后在 37振荡培养 30min。 4) 从管 1 中取 50L 涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管 2 中取 50L 和100L 涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约 10 分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养 20 小时。图 2 转化涂板
22、模式图5.5 GFP 蛋白的诱导表达1) 取阳性克隆质粒 DNA 转化 BL21；2) 在含有 Kan 的固体培养基上，37培养 20h；3) 挑取单菌落，37振荡培养过夜；4) 取 4 支无菌带盖试管，加入新鲜 LB 液体培养基（含有 Kan ）5ml，按 1：20 稀释比例加入过夜菌，37培养至生长期,约 2-3 小时。5) 加入 IPTG（1：1000）至终浓度 1mmol/L，分别诱导 0h，1h，2h，4h。 6) 分别取 1.5ml，10000rpm 离心 5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。管 1 管 1 管 2 管 250L 50L 50L 100L147) 分别
23、取 IPTG 诱导培养液 20l 涂布在含 Kan 的固体培养基上，37培养 20 小时。8) 观察蛋白表达：用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。5.6 绿色荧光蛋白的粗提取1) 挑取上述鉴定正确的单菌落接入 5 mL 液体 LB 培养基( 含 50 g/mL 卡那霉素) , 37 振荡培养过夜, 2) 将过夜培养菌以 1: 500 体积比接种入新的 LB 液体培养基扩大培养, 37 培养 1 h 后, 加入 0.1 mmol/L IPTG 诱导表达 3 h。3) 将上述诱导表达菌液 4 、5 000g 离心 10 min
24、收集菌体, 4) 用提取缓冲液(2 mmol/L Tris, pH 8.0, 0.5 mmol/L PMSF,0.2 mmol/L NaN3)洗涤菌体一遍, 5) 将菌体超声破碎( 50 %功率, 超声 20 s, 共 20 次, 两次超声间隔 40 s) 后, 10 000 g 离心 20 min。6) 取离心后的上清，即为粗提取绿色荧光蛋白。参 考 文 献1 Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the
25、 luminous hydromedusan, Aequorea J. J Cell Como Physiok, 1962, 59: 223-239.2 Kain SR,AdamsM, Kondepudi A, et al. Green fluorescent p rotein as a reporter of gene exp ression and p rotein localization. biotechniques, 1995, 19 (4) : 6503 Phillip s GJ. Green fluorescent p rotein - a bright idea for the
26、 study of bacterial p rotein localization. FEMSmicrobial Lett, 2001, 204 (1) : 9154 ChalfieM, Tu, EKivchen G, et al. Green fluorescent p rotein as a marker forgene exp ression. Science, 1994, 263(5148) : 8025 ChalfieM. Green fluorescent p rotein. Photochem Photobiol, 1995, 62 (4) : 6516 Larrick JW,
27、Balint RF, Youvan DC. Green fluorescent protein: untapped potential in immunotechnology. Immunotechnology, 1995, 1 (2) : 837 萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南M. 金冬雁，黎孟枫，译. 2版. 北京：科学出版，1995. 8 杜祯, 马海利, 陈瑞芳.工程菌 DH-5 感受态细胞的制备及质粒 pGEM 的转化研究 中国畜牧兽医,2007 年第34卷第5期9 Nuc P. Nuc K. Recombinant protein product
28、ion in Escherichia coliJ.Postepy Biochem,2006,52 (4):448-456.10 Dong X,Tang B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli J.J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299-307.11 吕素芳，刘峥，郭广君 ，蔡永萍，邱德文 大肠杆菌中表达外源重组蛋白的研究 12 魏春红，李毅主
29、编 原核细胞中外源基因的表达和初步纯化，现代分子生物学技术，高等教育出版社，2006.7:95-97附 录1 LB 培养基的配制：组成 液体 固体蛋白胨（Trypton） 10g 10g16酵母提取物（Yeast Extract）5g 5gNaCl 10g 10g琼脂（Agar） 15g蒸馏水 定容至 1000ml 定容至 1000ml2. 溶液： 50mM 葡萄糖25mM Tris-HCl（pH8.0）10mM EDTA3. 溶液（现用现配）： 0.2N NaOH1% SDS（先加水，再加 NaOH 和 SDS）4. 溶液（100ml ）：5M KAc 60ml冰醋酸 11.5ml5. DN
30、ase-free RNase A：溶解 RNase A 于 TE 缓冲液中，浓度为 10mg/ml，煮沸 10-30min，除去 DNase 活性， -20贮存。6.TE 缓冲液（ pH8.0）10mM Tris-HCl；1mM EDTA的配制：药品名称1M Tris-HCl（pH8.0） 10ml 1ml0.5M EDTA 2ml 0.2mlddH2O 定容至 1000ml 定容至 100ml7. 20TBE：216g Tris 碱， 110g 硼酸，80ml 0.5M EDTA（pH8.0 ） ，定容至 1000ml。178. GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液6loading buf
31、fer：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青 FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。配制好后可以按 50：1 的比例稀释 GeneFinder。9PEGFP-N 3 质粒全图谱实验使用的 EGFP 蛋白取自原核-真核穿梭质粒 pEGFP-NB3B 的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于 PCMV 真核启动子与 SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的 EGFP 编码序列与位于 EGFP 上游的多克隆位点；一个由 SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在 EGFP 编码序列上下游，存在特异的 BamH I 及 Not I 限制性内切酶位点，可切下整段 EGFP 编码序列。1810pET-28a 质粒全图谱表达 EGFP 蛋白使用的 pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的 His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的 T7 启动子，T7 转录起始物以及 T7 终止子；选择性筛选使用的 lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链 DNA 产物的 f1 启动子。19
