1、二、Bradford 法(一） 、原理：考马斯亮蓝 G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在 595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250 在 2 分钟内即可完全与蛋白结合，并在 2 小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate） ，Triton X100 等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。（二）器材及试剂 1、器材A. 分光光度计B
2、. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂 （1）考马斯亮蓝 G-250 溶液：称取 CBB- G-250 100 毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入 100 毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至 1000 毫升。（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取 10.0 毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至 100 毫升。(4) 血清样品(已稀释 200 倍 )(5) 层析样品(三） 、操作（标准曲线制作） ：取 7 支试管按下表操作：空白 待测 标 1 标 2 标 3 标 4 标 5标
3、准蛋白 （ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测样品 2（ml） 0.2 生理盐水（ml） 1.0 0.8 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0CBB-G250(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0最终蛋白浓度（ug/ml） 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5混匀，室温放置 5 分钟，在 595nm 测定各管 O.D 值并以蛋白浓度为横坐标，以 O.D值为纵坐标绘制标准曲线以 Bradford 法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取 20.0ul，加入生理盐水 20ul,最后加入考马斯亮蓝 G-250 溶液5.0ml，混匀，以 59
4、5nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是 1976 年 Bradform 建立。考马氏亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从 465nm 转移到 595nm 处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm 的吸光度成正比。【器材与试剂】器材 1.可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液枪 4. 新鲜
5、小麦叶片或绿豆芽下胚轴等试剂 1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂 称取 CBB- G-250 100 毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100 毫升 85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至 1000 毫升。3. 1000g /ml 蛋白质标准液 标准蛋白质溶液（1000ug/ml）：精确称取 100.0 毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至 100 毫升。【实验步骤】1. 标准曲线的制作(1) 取试管 6 支，按下表进行编号并加入试剂。试管编号试 剂1 2 3 4 5 61000g/ml 标准蛋白溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.
6、9%生理盐水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0蛋白质含量（g/0.1ml） 0 20 40 60 80 100(2) 另取试管 6 支，吸取上述各管蛋白质溶液 0.1ml，加入 3.0ml 考马斯亮蓝G250 试剂, 充分振荡混合，放置 5min 后，测定 A595 值。(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法（分组实际操作、讲解）注意事项：(1) 持杯方法(2) 一定要开盖调 T 零点，盖盖调 T 100(3) 波长选择(4) 空白杯所装的溶液(4) A595 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。2. 样品提取液中蛋白质含量的测定(1)蛋白质提取:称取样
7、品约 200mg，加蒸馏水 5ml，匀浆，4000rpm 离心10min，取上清液。残渣用 2.0ml 蒸馏水悬浮，4000rpm 离心 10min，合并上清液并定容至 10ml。(2)蛋白质含量测定: 取 3 支试管，各吸取样品提取液 0.1ml，加入考马斯亮蓝G250 试剂 3.0ml，充分振荡混合，放置 5min 后，测 A595 值(3) 根据 A595 值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。3. 结果计算样品蛋白质含量（g/g 鲜重）a (g) 提取液总体积 (ml) / 测定所取提取液体积（ml）样品鲜重（g）, a 为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为 g【实验结果与分析】写出实验报告
