1、CAR-T 细胞制备整理文献来源一：“Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood”作者：M. Helen Huls 1.1、制备：1）采集样本后，制备分离，首先用 PBS 进行外周血等体积，脐血四倍体积稀释。2）将稀释后的血，50ml 的量加到装有 12ml 分离液的 50ml 离心管中,400g 离心 30-40min.3） 收集白膜层单
2、个核细胞到新的 50ml 离心管当中，加入 PBS 定容到 50ml，450g 离心10min.4）去除上清，重悬细胞沉淀用 50ml 完全培养基，然后 400g,离心 10min.5）去上清，细胞继续用完全培养基重悬，然后胎盼蓝细胞计数。6） MNC 细胞用于电穿孔核转染载体或者冻存备用。2、预处理A、如使用冷冻保存的 MNC，在 37 度条件下迅速解冻细胞进行全面的电穿孔(2 x 108+20%，以计算细胞损失在离心及 2h 孵育过程中) 。如使用新分离制备 MNC，则按照2.3 操作进行。B、温和地重悬细胞并且转移到适当大小的离心管中，离心管中预先添加的完全的无酚RPMI 培养液。200
3、g 离心 10min，去上清。C、用 PF-RPMI 重悬 MNC，取样进行细胞计数，按 106/ml 的密度接种到合适的培养容器中。D、在 37 度条件下， 5%CO2,孵育 2h。E、将 MNC 转移到无菌的离心管中，200g 旋转 5 分钟，去上清，然后用 PF-RPMI 温和的重悬细胞沉淀。F、计数细胞，并且定容，细胞要求为 2*108.G、将细胞悬液转移到无菌 50ml 的离心管上，200 g 旋转 10min。H、去上清，温和的重悬细胞。3、电穿孔细胞4、人工抗原递呈细胞介导的刺激 CAR-T 细胞电穿孔转染后的细胞（表达 CAR） ，在无菌容器中 辅射处理后的 aAPC 细胞按
4、1：2与 CAR+细胞在完全培养基中混合，添加 IL-21(30ng/ml),分装至 T75 培养瓶或者培养袋中，接种量为 106/ml，细胞进行培养。5、 CAR-T 细胞的培养半量换液，补充添加 IL-21,维持细胞密度为 106/ml.文献来源二：“特异性人工抗原提呈细胞体外激活 CD 19 嵌合抗原受体 T T 细胞的构建” 作者：彭耀军制备：1）慢病毒载体的构建；2）慢病毒包装及转染；3） CD19CAR 结构及 CAR-T 细胞制备：采用 Ficoll 淋巴细胞分离液分离获得健康人外周血单核细胞（PBMC） ，在 24 孔板中培养，同时加入 CD3/CD28 抗体偶联磁珠（Invitrogen 公司）刺激 PBMC，24 h 及 48 h 后加入 CD19CAR 病毒感染 2 次，病毒感染时加入 IL-2（300 U/ml） ，CAR-T 细胞扩增至第 6 或 7 天后检测 CAR 基因表达及用于后续实验。
