1、1高中生物选修一生物技术实践 知识点总结专题一 传统发酵技术的应用 课题一 果酒和果醋的制作1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C 6H12O66O 26CO 26H 2O5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C 6H12O62C 2H5OH2CO 26、20左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在 18-257、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在
2、葡萄皮表面的野生型酵母菌。在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色。在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 2C 2H5OH4O 2CH 3COOH6H 2O10、控制发酵条件的作用醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为 3035，控制好发
3、酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。11、实验流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋）12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液 2L，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污
4、染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。酶酶酶2疑难解答（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。（3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在 1825？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 3035？温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其
5、最适温度范围内。而醋酸菌是适温菌，最适生长温度为 3035，因此要将温度控制在 3035。课题二 腐乳的制作1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。3、实验流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期发酵主要是酶与微生物协
6、同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。5、将豆腐切成 3cm3cm1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为 70左右，水分过多则腐乳不易成形样品水分含量（%）计算公式：(烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 1518，并保持一定的温度。3来源：1.来自空气中的毛霉孢子 2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5 天加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右。用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓
7、度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质 2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂 3.调味作用，给腐乳以必要的咸味 4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在 12%左右。酒的作用：1.防止杂菌污染以防腐 2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味 3.酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快
8、，豆腐易腐败，难以成块。香辛料的作用：1.调味作用 2.杀菌防腐作用 3.参与并促进发酵过程防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。疑难解答（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。（2）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？含水量为 70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。（3）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎
9、样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。课题三 制作泡菜制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸。4分裂方式是二分裂。反应式为：C 6H12O6 2C3H6O3+能量 酶常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外
10、，但在适宜 pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在 10 天之后食用最好*测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。专题二 微生物的培养与应用课题一 微生物的实验室培养培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌
11、落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物
12、。培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO 3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH 3、NO 3-、NH 4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用 N2。培养基还要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要5在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的 pH 调至酸性，培养细菌是需要将 pH 调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物
13、是则需要提供无氧的条件无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些
14、不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形
15、瓶，将瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。6等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，
16、凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将
17、菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速7伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端
18、开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在
19、灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想
20、，第 2 步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入84的冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，
21、与甘油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存。疑难解答（1）生物的营养人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。（2）确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温 12 天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶尿素最初是从人的尿液中发现的筛选菌
22、株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入9有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的
23、原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入 TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。
24、从富含有机物、潮湿、pH7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 38cm 的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 30300 之间，适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106测定放线菌的数量，一般选用 103 104 105测定真菌的数量，一般选用 102 103 104（3）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌 3037 12 天放线菌 2528 57 天 霉菌 2528 34 天每隔 24 小时统计一次菌落数目，选
25、取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征（形状、大小、隆起程度、颜色）疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表10涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M 代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分离纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类
26、物质。纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1酶、C X酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的
27、纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛
28、选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。11疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约 10cm 左右腐殖土
29、壤中。（3）两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的
30、条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。专题三 植物的组织培养技术 课题一 菊花的组织培养植物组织培养的基本过程细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分
31、化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物细胞工程具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都12具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。比较根尖分生组织和愈伤组织的异同影响植物组织培养的条件材料：不同的植物组
32、织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素是 N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动
33、细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将 pH 控制在 5.8 左右，温度控制在 1822，并且每日用日光灯照射 12h. 使用顺序 实验结果先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化同时使用 分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时 促根分化，抑芽形成比值低时 促芽分化，抑根形成比值适中 促进愈伤组织生
34、长组织类型 细胞来源 细胞形态 细胞结构 细胞排列 细胞去向根尖分生组织受精卵 正方形 无液泡 紧密分化成多种细胞组织愈伤组织 高度分化细胞 无定形 高度液泡化 疏松 再分化成新个体相同点 都通过有丝分裂进行细胞增殖134、操作流程配制 MS 固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到 1000 毫升。在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。MS 培
35、养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS 培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主，MS 培养基则需提供大量无机营养。外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗 20min 左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为 70%的酒精中摇动 23 次，持续 67s，立即将外植体取出
36、，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中 12min。取出后，在无菌水中至少清洗 3 次，漂洗消毒液。注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种 78 个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行
37、壮苗。最后进行露天栽培。栽培 外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。专题二 月季的花药培养被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4 个单倍体细14胞连在一起，进入单核期时，四分体的 4 个单倍体细胞彼此分离，形成 4 个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细
38、胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成 1 个生殖细胞核和 1 个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。注意：成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的 4 个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一
39、对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。注意：无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根 胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。影响花药培养的因素诱导花粉能
40、否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高花蕾：选择完全未开放的花蕾亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色材料的消毒接种和培养：灭菌后的花蕾，
41、要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药 710 个,培养温度控制在 25左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过 2030 天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化15出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来的植株做
42、进一步的鉴定和筛选。植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。专题五 和蛋白质技术课题一 的粗提取与鉴定提取 DNA 的溶解性原理包括哪些方面？DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精。DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度有何特点？要使 DNA 溶解，需要使用什么浓度？要使 DNA 析出，又需要使用什么浓度？在 0.14mol
43、/L 时溶解度最小；较高浓度可使 DNA 溶解；0.14mol/L 可使 DNA 析出。在溶解细胞中的 DNA 时，人们通常选用 2mol/LNaCl 溶液；将 DNA 分子析出的方法是向溶有 DNA的 NaCl 溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释 NaCl 溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但 DNA 却不能溶于酒精（特别是 95冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂。采用 DNA 不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？将 DNA 和蛋
44、白质进一步分离。提取 DNA 还可以利用 DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对 DNA 产生影响。温度值为 6080，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而 DNA 不会变性。补充：DNA 的变性是指 DNA 分子在高温下解螺旋，其温度在 80以上，如在 PCR 技术中 DNA 变性温度在 95。洗涤剂在提取 DNA 中有何作用？16洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。当鉴定提取出的物质是否是 DNA 时，需要使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺呈现蓝色。原理总结：通过利用不同
45、浓度 NaCl 溶液溶解或析出 DNA，可以从细胞中提取和提纯 DNA；再利用酒精进一步将 DNA 与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是 DNA。实验材料的选取不同生物的组织中 DNA 含量不同。在选取材料时，应本着 DNA 含量高、材料易得、便于提取的原则。本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的 DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少 DNA 的损失，最好使用塑料
46、的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。破碎细胞，获取含 DNA 的滤液若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含 DNA 的滤液？在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA。在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解 DNA 物
47、质；选用尼龙布进行过滤。在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？破碎细胞壁，使核物质容易溶解在 NaCl 溶液中；研磨不充分会使 DNA 的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。具体做法。10mL 鸡血20mL 蒸馏水同方向搅拌3 层尼龙布过滤滤液去除滤液中的杂质17为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使 DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。最初获得的 DNA 滤液含
48、有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯 DNA。方案一的原理是 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解 DNA；方案三的原理是蛋白质和 DNA 的变性温度不同。方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与 DNA 分离。析出与鉴定在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的 DNA 呈何颜色？滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置 23 分钟，析出的白色丝状物就是 DNA。DNA 呈白色。怎样鉴定析出的白色丝状物
49、就是 DNA 呢？具体做法。试管 2 支，编号甲乙各加等量 5mLNaCl 溶液甲中放入少量白色丝状物，使之溶解各加 4mL 二苯胺，混合均匀沸水浴 5min观察颜色变化实验操作制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放 DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内 DNA 加入 NaCl 至 2mol/L，同一方向缓慢搅拌DNA 析出 加蒸馏水至 0.14mol/L，过滤，在溶解到 2mol/L 溶液中除去细胞质中的大部分物质。DNA 初步纯化 与等体积 95冷却酒精混合，析出白色丝状物18除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA 鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使
