1、胚胎植入前遗传学诊断的失误及改进 朱前勇 综述 颜建华 审校 20 世纪 90 年代初以来，随着分子生物学技术的日益完善，胚胎植入前遗传学诊断(preim plantation genetic diagnosis， PGD)的发展十分迅速，临床上可以鉴定性别，诊断多种单 基因病及染色体病，全世界已有近百例婴儿经 PGD 后诞生。但临床上 PGD 仍存在 20%左右的误 诊率1，主要在于微活检技术的有效性不足和 PGD 常用的两种分析方法，即聚合酶 链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)在利用单细胞做底物时存在着缺陷。许多学者针对这些 原因开展了一些新的方法，本文就 PGD 的误诊原因及改进
2、作一综述。 1 显微活检技术的有效性 PGD 无论从卵细胞的极体还是从卵裂球中取材，都需要运用微活检技术，这是 PGD 技术的一 个难点。Reubinoff2报道：28%的卵细胞由于活检操作失误而不能用于 PGD，原因 在于分离紧密连接的卵裂球能损伤细胞膜。Shee3把常规活检时分别用来固定囊 胚、酸溶透明带、抽吸卵裂球的 3 个吸管，减少为用 2 个，1 个仍固定囊胚，另 1 个先用酸溶蚀 透明带，然后把酸吸回再抽出卵裂球。这大大缩短了活检时间，且在透明带上溶开的孔径与 吸管直径相同但略小于卵裂球的直径，从而避免活检后细胞质流出和细胞膜破裂。该法使活 检的有效性提高了 10%3 。另外， C
3、ieslak 报道新开展的三维透明带部 分切开术用于卵裂球活检，是在透明带上做一个 V 形切开( 交叉裂口)，造成一个三角边口， 足够微吸管进入胚胎取出裂殖细胞。行胚胎活检时，转动胚胎直至 V 形切口置于 3 点处，固定 胚胎，微管进入焦距，施少许压力向上压开三角形叶片即插入胚胎，能在不扭曲胚胎卵裂球 外形下吸出裂殖细胞，三角叶片在微管离去后复位，在移植过程中可保护胚胎。该术不同于 用微针在透明带上造一裂口的传统方法，是一种安全、简单、有效的机械性透明带部分切开 造口术。 Markus 用激光在透明带上打孔但尚未用于人胚检查。总之，如何提高显微活检技术 的准确性及有效性还需进一步研究。 2 如
4、何避免 PCR 中等位基因的缺失及提高 PCR 的效率 1985 年 PCR 技术建立后，Handyside 于 1990 年首先应用于临床 PGD，1994 年 Ray 利用单细胞底 物以 PCR 诊断囊性纤维病(CF)时，发现了等位基因的缺失现象(allele drop-out，ADO)，即 ：以单细胞底物诊断单基因缺陷病时，如在杂合子的单细胞中，两个等位基因之一未被扩增 。这是导致 PGD 误诊的主要原因。ADO 在理论上由 Navidi 和 Arnheim 在 1991 年提出，1994年才 在临床上引起足够重视。Grifo 在 1994 年、Verlinsky 在 1996 年相继报
5、道过 ADO 导致误诊的病 例。 Ray 在诊断 CFF508 基因突变时，出现了 25%的 ADO 率4。Levinson 在1992 年利 用多重 PCR 鉴定胎儿性别的研究中其 ADO 率是 21%。最低的 ADO 率是 Storm 在168 个杂合子细胞的 扩增中仅一个表现为 ADO(0.6%)1。在原位 PCR 中，ADO 的发生率也有 12%5 。 ADO 发生的原因主要为：染色体嵌合体，尤其是除了具有二倍体细胞外，有些细胞是单 倍体时，易致误诊，减少这类误诊的唯一办法是从 1 个囊胚中取 2 个细胞来分析。在操作前 溶细胞的方法对 ADO 率的影响较大，用强碱溶解，ADO 率较低
6、，Gitlin、Wu 等用强碱和 DTT及 蛋白酶 K 两种方法溶细胞，然后用 PCR 诊断 CFF508 时，ADO 率分别为 10%和19%。PCR 开始时 的变性温度也非常关键，变性温度分别为 90、93、96时，用 PCR诊断 CFF508 基因突 变时， ADO 率依次为 21%、13% 、5%6 。 此外，为了降低 ADO 率，除了上述严格的溶细胞条件、变性温度外，许多学者建立了一些 新方法。Findlay 提出荧光 PCR，即 PCR 产物通过荧光标记的引物被标记上了荧光，较容易检 测 ，此项技术较常规 PCR 灵敏 7，8。Sermon 利用荧光 PCR 诊断 CFF508 突
7、变，ADO 率 仅 5%，用常规 PCR 对比则为 21%1。Kuliev9利用细胞的第一、二极体 诊断 -地中海贫血时，从一个杂合子细胞中同时扩增二个突变基因，如扩增结果表现为纯 合子，则表明出现了 ADO。Sermon 又介绍了多态 PCR：扩增 CFF508 突变和其附近的具有多态 性的第六内含子。根据两个位点的一致性结果来做出诊断是否出现了 ADO，从而避免误诊 1 。 3 FISH 和原位 PCR FISH 运用于 PGD，首先是鉴别胎儿性别以避免性连锁遗传病的发生，因可 同时检测X、Y 染色体，准确性较 PCR 高；其次可用来诊断染色体非整倍体。重要的是 FISH 可 以诊断复杂的
8、染色体易位、转位等畸变，但目前关于这方面的进展不大，主要是卵裂球中期 核染色体不易获得；且每例病人都要用一种特异的 DNA 探针，探针的制备又较繁杂，一般实 验室无法开展。针对这种情况，许多学者进行了尝试：Munne10用自第一极体中 获得的涂染染色体去分析第一极体中的染色体易位。共检测 8 例平衡易位携带者，其中 5 例已 妊娠，2 例健康的新生儿娩出，使平衡易位携带者的流产率从 95%降到 12.5%；Conn 11 用点探针检测罗伯逊易位携带者的非整倍体，亦获得一定效果。但这两种方法只能检 测来自母体的易位情况，比较局限。湖南医科大学介绍了一种新的探针标记方法：直接对涂 染探针进行 PC
9、R 标记，通过合适的 PCR 引物扩增，把生物素渗入到被扩增的 DNA 链中，该技术 缩短了探针制备的过程12。有专家预言：随着 DNA 探针标记技术、制备技术、杂 交结果及图像分析技术的发展以及高分辨的 FISH 作图技术、比较基因组杂交技术的问世，FI SH 会得到不断创新和发展，尤其是染色体平衡易位的诊断将广泛应用于临床，从而可大大提 高 PGD 的准确性和 IVF 的成功率。 为了进一步提高以单细胞底物进行 PGD 的效率，Thornhill13提出了原位 PCR： 在固定于载玻片上的同一个单细胞上，先用 PCR 原位扩增，再用 FISH 检测。该技术可使性别 鉴定、单基因病和染色体病
10、的诊断同在一个细胞上进行，被称为目前最先进的技术。经过一 段时间的探索和研究，目前 PGD 中应用原位 PCR 时，PCR 的有效率为 65%，FISH 达 85%。遗憾的 是Rechisty 报道 ADO 率较常规 PCR 高。相信随着引物设计及荧光 PCR 与原位 PCR 有效的结合，原 位 PCR 的不足会得到克服且可能逐步替代 FISH 在 PGD 中的作用。 4 结语 经过近 10 年的发展，利用 PGD 已能成功地诊断囊性纤维化病、-地中海贫血，马凡综合征 、Staeinert 病、1- 抗胰蛋白酶缺乏病、Lesch-Nyhan 综合征等近 50 种单基因病及染色体 病。据美国的一
11、项问卷调查：PGD 避免了流产的痛苦，伦理上易于接受。但在临床应用中，P GD 仍有几个问题值得重视。首先，由于试管婴儿成功率较低，妊娠率约 20%，分娩率约10%， 而接受 PGD 的病人一般都有正常的生育率，故对他们而言临床妊娠率低难以接受。其次，PGD 费用昂贵，其研究工作主要集中在英美等发达国家，如何降低 PGD 的费用，从而使PG D 广泛开展，也是亟待解决的的问题。最后，PGD 的历史较短，对经 PGD 而诞生的儿童的未来 健康 状况，尚需长时间随访。有理由相信，随着分子生物学等技术的日新月异， PGD 的前景将是 非常令人振奋的! 作者单位：朱前勇(第三军医大学附属大坪医院妇产科
12、 重庆，400042) 颜建华(第三军医大学附属大坪医院妇产科 重庆，400042) 参考文献 1,Willy Lissens ,Karen Sermon.Preimplantation genetic diagnosis:curre nt status and new developments.Hum Reprod,1997;12(80):1756 2,Reubinoff BE,Shushan A.Preimplantation diagnosis in older patients to biopsy or not to biopsy.Hum Reprod,1996;11:20771 3,
13、Shee U C,Kuang H C,Ming Y W,et al.The simplified two-pipe tte techniqe is more efficient than the conventional three-pipette method for b lastomere biopsy in human embryoes.Fertil Steril,1998;69(3):569 4,Ray PF,Winston RML ,Handyside AH.Reduced allele dropout in single -c ell analysis for PGD of cys
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