1、凯氏定氮操作步骤1消化：精密称取大豆样品 1.0g 左右，放入干燥的 250 ml 消化管中，加入0.4g CuSO4、7g K2SO4、10ml H2SO4。先 200炭化，待泡沫停止后提高温度到 450，加热至液体沸腾，待瓶内液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。冷却后加入 20ml 水，移入 100ml 容量瓶中，用少量水洗涤消化管23 次，洗液合并于容量瓶中定容2蒸馏：连接凯氏定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至 2/3 处，加甲基红指示剂数滴及数 ml 硫酸，保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，调节火力加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。3吸收：向吸收瓶内加入 20g/L 硼酸溶液 20ml
2、 及混合指示剂 2 滴，并使冷凝管下端插入液面以下，吸取 10ml 样品消化稀释液由进样口进入反应室，并以 10ml 水洗涤进样口使其流入反应室内，将 400g/L NaOH 溶液 10ml 倒入进样口，立即夹紧螺旋夹，并加入少量蒸馏水，密封进样口。当蒸汽通入反应室时，准确计时，反应产生的氨气通过冷凝管进入吸收瓶，蒸馏5min，移动吸收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。洗涤：停止加热，使反应室内的液体进入汽水分离器，打开进样口的螺旋夹，将汽水分离器的液体放出。再向反应室内加入蒸馏水，夹紧螺旋夹，再次进行加热至水蒸汽放出，停止加热，使反应室内
3、的水进入汽水分离器，进行洗涤。4滴定：用 0.025mol/L 硫酸标准溶液滴定吸收液至灰色。5计算：X2cV 145.71/mX 为样品中蛋白质的含量，；c 为硫酸标准溶液的浓度，mol/L；V 为样品消化液消耗硫酸标准溶液的体积，ml；m 为样品的质量，g。凯氏定氮法凯氏定氮法是测定蛋白质的国标方法。2%硼酸溶液是测定方法中碱化蒸馏时所使用的吸收液，用来吸收游离出的氨，然后用盐酸或硫酸标准溶液滴定，根据混合指示剂颜色变化判断终点。1 试剂与方法1.1 2%硼酸吸收液的配制方法 (1)将 2 份 0.1%甲基红乙醇溶液与 1 份 0.1%次甲基蓝乙醇溶液混合。(2)将适量上述混合指示剂一次性
4、加入已配制好的 2%硼酸溶液中，使溶液呈蓝紫色。1.2 2%硼酸吸收液使用方法 按照国标方法（GB5009.585 ）操作，在平行试验时，可将已滴定至终点的 2%硼酸吸收液重复使用。1.3 配制方法 配制 2%硼酸吸收液时，混合指示剂加入量不宜过多，以透过试剂瓶观察蓝紫色刚好透明为宜。若溶液偏蓝，用 0.1%甲基红乙醇溶液调至蓝紫色；反之若偏紫红，可用 0.1%次甲基蓝乙醇溶液调至蓝紫色。1.4 配制后的 2%硼酸吸收液可行预试验 即取少量吸收液于试管中，加入 1 滴氨水（ 1+2）观察其颜色变化是否明显与正常。1.5 反应原理 样品中的蛋白质经硫酸和催化剂消化后，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵
5、，然后碱化蒸馏使氨游离，用 2%硼酸溶液吸收生成硼酸铵。其反应为：2NH3+4H3BO3（NH4）2B4O7+5H2O 使吸收液由酸性变为碱性，混合指示剂由蓝紫色变为绿色，然后用盐酸或硫酸标准溶液滴定，使混合指示剂再由绿色返至蓝紫色即为终点。重复使用时，仍可按上述原理反应。1.6 终点颜色 滴定终点观察颜色时，样品消化液终点与空白消化液终点应色调一致。2 结果一次使用 2%硼酸吸收液的国标方法与重复使用 2%硼酸吸收液的新方法进行对照实验，经 t 检验，t=0.676, P0.05，两种使用方法差异无显著性。对照实验结果见表 1。表 1 对照实验结果（略）3 讨论用一次性加入混合指示剂的方法配制 2%硼酸吸收液，将已滴定至终点的吸收液重复使用，用于平行实验。这样可简化实验操作，尤其在进行批量样品检验时，对于 2%硼酸吸收液可不必逐个滴加混合指示剂，减少 50%吸收次数，节约 50%用量，从而提高工作效率和经济效益。
