1、骨髓基质干细胞 BMP-2 和 bFGF 基因的联合修饰ISSN10078738 细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmuno1)2006,22(2)?论着?133文章编号:10078738(2006)02 013304骨髓基质干细胞 BMP.2 和 bFGF 基因的联合修饰李毅,陈槐卿,成敏,唐艳娟(四川大学华西医学中心生物医学工程研究室,四川成都610041)BonemarrowstromalcellsCO.modifiedwithBMP-2andbFGFgeneY/,CHENHuaiqing,CHENGMin,TANGYan-juanInstituteofBiomedic
2、alEngineering,WestChinaMedicalCenterofSichuanUniversity,Chengdu610041,ChinaAbstractAIM:Toestablishmodifiedbonemarrowstromalcells(BMSCs)whichcanexpressBMP-2andbFGFstably.METHODS:BMP-2andbFGFgenewereamplifiedbyRTPCR,andthenclonedintotheexpressionvectorpcDNA3.0.AfterbeingconfirmedbyDNAsequencing.pcD-NA
3、3.0-BMP-2andpcDNA3.O-bFGFwereCO-transfectedintoratBMSCswithLipofectamine2000reagent.TheexpressionofBMP-2andbFGFgeneinratBMSCswasdetectedbyRT-PCR,Westernblot,immunohistochemicalstainingandELISA.RESULTS:BMP-2andbFGFgenewerecloned,andtheirsequenceswereidenticalwiththoseinGenBank.Theexpressionplasmids.p
4、cDNA3.0-BMP-2andpcDNA3.0 一bFGF.wereconstructedandCO.transfectedintorMSCssuccessfully.RT-PCRshowedthemasstranscriptionofBMP-2andbFGFmRNAintransfectedBMSCs.Westernblot,immunohistochemicalstainingandELISAconfirmedtheexpressionofBMP-2andbFGFgenesintransfectedcellsandinthesupernatant.CONCLUSION:Wehavecon
5、-structedtheoptimalratBMSCswhichcanbeusedinbonetissueengineering.Keywordsbonemarrowstromalcell;BMP-2;bFGF:genetransfection摘要目的:建立能够稳定表达 BMP.2 及 bFGF 的骨髓基质干细胞,优化骨组织工程种子细胞.方法:通过 RT.PCR方法获取全长 BMP-2 及 bFGF 基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后 ,经脂质体介导导入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞,G418 筛选稳定表达株.利用 RT.PCR,Westernblot,ELISA,免疫组织化学
6、染色方法分析转染细胞外收稿日期:20050901;修回日期:20051017基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助(No.2002AA326080)作者简介:李毅(1976 一), 男 ,湖北武汉人,博士生.Tel:(028)85502314;Email:yileeOl03yahoo.COIII.CI1Correspondingauther,Email:源基因表达情况.结果:成功构建了全长 BMP-2 及 bFGF 的真核表达载体,转染大鼠骨髓基质干细胞后经 G418 筛选获得稳定表达株.RT-PCR 结果显示稳定转染细胞中具有大量目的基因 mRNA 转录,ELISA 检测培养上清中目
7、的蛋白表达阳性,Westernblot,免疫组化结果显示胞质中有目的蛋白的表达.结论:获得了可以稳定表达 BMP-2 及 bFGF 的骨髓基质干细胞,有利于组织工程骨缺损修复中的应用.关键词 骨髓基质干细胞 ;BMP 一 2;bFGF;基因转染中图分类号R318.5文献标识码A骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcel1)是一类来源于骨髓,具有自我更新能力和多分化潜能的多能干细胞.在特定的培养条件下,可分化为成骨细胞,软骨细胞,内皮细胞等间充质细胞,并且具有来源广泛,易于分离培养等特点,因此成为组织工程最为理想的种子细胞.而骨形态发生蛋白(bonenlor.phogenticpr
8、otein,BMP)是惟一一类能够启动成骨分化,并作用于成骨整个过程的细胞因子.其中 BMP 一2 以其突出的骨诱导活性,已被广泛应用于骨组织工程领域.碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)是一种广谱的有丝分裂源 ,对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用,不仅能够促进软骨及骨组织的形成,并且是一种强烈的毛细血管形成刺激剂.本实验中拟对骨髓基质干细胞进行多基因修饰,以期获得成骨和成血管性能更好的种子细胞,为大面积骨缺损和骨不连的治疗提供良好途径.1 材料和方法1.1 材料 ReverseTranscriptase(AMV)为 Pr
9、omega 公司产品;LATaqDNA 聚合酶,限制性内切酶 EcoRI,XbaI,HindIII.T4DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司;质粒提取试剂盒为上海华舜生物公司产品;E.Z.N.AGelExtractKit 为美国 Omega 公司产品;免抗人 BMP 一 2 抗体,兔抗人 bFGF 抗体购自 SantaCruz公司;Actinantibody(goatpolyclonalIgG),pcDNA3.0,TRIzol试剂,Lipofectamine2000reagent,抗生素 G418 购自美国 In.vitrogenCorp.公司;DMEM(LG)培养基,胎牛血清购自美国Gib
10、co 公司;Percol1 分离液购自 AmemhemPharmacia 公司;IIilllIII?0II,cllll1Il:I),1lI.IL.I.I物-_rlI】fJII-h 一鼻一 JlI:41I,hIiu1L.:【-ilIll 一 J 物 iLJIII2 方法I2lID,I12,!一 I(.h屯 Ig 戎 j 芝眦 1,Jj,Ili_l【.-LJ-t0Ii,10f11fII-I,圳川 jI,I:5fr(r,IIuL(?一i.i,I,.:I?晰:5 一(,1.,I:I,lI,IrtI,II.,(.一.:【HrI,l1 扭 t 剖 ll12I:.:Ig-I 埘:5,II:,IIq,1I,1
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14、F 基因的克陛殛真桩表达载体的建立刊川 I(1l一 rJ00?I),I1iI1 氟 f-hr 卜_j+ 引一,I 丘小 J4TII,If:.rI.,J 一 I)N-,I1.l.l,IIM1-2Kl1凡-J,J 坷 IIhpH;Jr 剖 I1,10It;吐 rL 蚀良 1川 jIII,jflI“lj 廿圳批 15t)1)hi,t:11I!IH)hl 一景=iJ.,jII“物 小登-J 生 fII,f 州廿“f.:JIjlJI“tlIlkIlLlJ.I3I1 十 1ll!州一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一=叫,虬 lJ“j 托.1 钉 fflrrnJ
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18、细胞培养上满中的蛋白表选转谁【 也Jnlil!iJ,qJLI l【1fl!llJlIP+Ii【1fInHhhII1IIJI,“II,iljIr_II_“IniilItl一f 引?I-IIIhh I 廿“rIllJ【.lIHl1fl:J 止 I 土hg5 一“rIlllI-IIILI,illl-IlI,In.hIl15.IIIIl.illIIIiI,lclirIIiII I2.1IlljIiiiiI.:2【ItlI_lI 一?IIIM,(Iif.JIIti.-iIhIIlIIl,1I!IIIIil ?,:ItIIIt,1lIIl,cIiIlI.IIII.$111jJH“t.IITI【il-*.,
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