1、非肥胖 2 型糖尿病胰岛素抵抗的病机研究中国医师杂志 2OO4 年 2 月第 6 卷第 2 期 l83非肥胖 2 型糖尿病胰岛素抵抗的病机研究陈慧玲,郭丽娟,廖岚,雷闽湘(中南大学湘雅医院内分泌科,湖南长沙 410008)【摘要】目的探讨胰岛素受体数目及其 B 亚基自身磷酸化程度改变在 2 型糖尿病患者胰岛素抵抗发生中的作用.方法 l4例非肥胖型 2 型糖尿病患者和 l2 例正常对照者,用放射配基结合法测定完整红细胞膜上胰岛素受体数目及其亲和常数,按 Comi 等人所述方法制备红细胞膜蛋白,用胰岛素及 732PATP 促发磷酸化反应,反应结束后进行不连续垂直板凝胶电泳(O,l%sDS7%5%P
2、AGE)分离蛋白质,并进行放射自显影,测定 95KD 蛋白质的吸光度.结果非肥胖型 2 型糖尿病患者,每个红细胞上胰岛素高亲和力位点数目为 2113,亲和常数为(1.700.93)x10I9LM.,低亲和力位点数目为 9554-427,亲和常数为(1.444-0.86)x10LM,与正常对照组相比,差异无显着性;非肥胖型 2 型糖尿病患者红细胞膜上95KD 蛋白的磷酸化程度为 8.024-5.60A/mg 蛋白,明显低于对照组 28.384-15.24AA/rag 蛋白结论胰岛素受体 B 亚基自身磷酸化程度的降低可能是非肥胖型 2 型糖尿病患者胰岛素抵抗产生的主要因素;胰岛素受体数目及其与胰岛
3、素亲和力的改变可能与非肥胖型 2 型糖尿病胰岛素抵抗的产生无关.【关键词】胰岛素受体;酪氨酸蛋白激酶;胰岛素抵抗;2 型耱尿病lavmaptioaofMechanismofImuUnResistanceinNonobeseType2DiabetesCHENHuiling,GUOLijuan,LIAOLan,eta1.DepartmentofEndocrinology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China【AbstnObjectiveToelucidatetheroleofi 日 suJjnIecepl0andit
4、spsubunitautophosphorylationinevokinginsulinresistanceinn一obesetype2diabetes.Methods14pmientswithnonobesetype2diabetesand12healthysubjectswereenrolledinthisstudy.1l 搬 IlinnumbersanditsinsulinaffinityinerythrocytesweremeasuredusiIlgradiolabelledlisabindingassaydescribedbyComiela1.Insulinlaptor肌 10f,h
5、cBph0rylationinerythrocytesmembranewssinitiatedbyaddinginsulinand7 一PATP.Thenthemembraneproteins 眦 resolvedon7.5%SDSPAGEandsubjectedtoautoradiography.ResultsThenumbemofhighandlowaffinityreceptorsinerythrocytesoftype2diabetesweJr214-13and9554-427percellrespectively,andtheyshowednosignificantdiH.erenc
6、eascomparedwithcontro1.Thehighaffinityc0 璐(KI)andlowamnityeonstant(K2)ofinsulinreceptorsinerythrocytesoftype2diabeteswere(I,704-O.93)x10 一LM 一and(1.444-O.86)x10LMre?speetlvely,alsodisphyingnosignificantdifferenceineompaJrlsonwiththecontro1.16tdininducedreceptorBsubunitautophosphimionw 勰 8.024-5.6/!A
7、/ragpmtdnintype2diabetes,whichwsslowerthanthat(28.384-15.24) A/mgprein)incontrol(PO.05).Q_c.I_幡 ThedecreaseinautophosphorylationofinsulinreceptorBsubunitmaybethemajort0revokinginsulinresistanceinnonobesetype2diabetes.Theehaninnumberandaffinityofinsulinreceorsmaynotberelatedtoinductionofinsulinresist
8、anceinnon 一 0type2diabetes.【KeyWordsInsulinreceptor;TymsineIdna;l 地 lIIinresistance;Type2diabetes胰岛素抵抗产生的确切机制尚不明了,但靶细胞膜上胰岛素受体数目和受体口亚基酪氨酸蛋白激酶活性的改变确与胰岛素抵抗(In)的产生有关.,. 胰岛素受体数目的下行调节可能是肥胖墅 2 型糖尿病的致病机制,引,但 Gmnber等】发现有严重胰岛素抵抗的患者,其单核细胞及红细胞膜上胰岛素的结合量并无参考文献I 李家邦,陈松.李立新.四君子汤对脾虚证模型大鼠淋巴细胞功能的影响J】.成都中医药大学.2ooi,24(3
9、):31322 陈松,李家邦,李立新.脾虚证与益气健牌治疗对 T,B 淋巴细胞活性影响的实验观察盯.湖南中医学院,2OOO.20(4):9113 邢同京,章廉主编.11I 类细胞极化群体的基础与临床M】.北京:军事医学科学院出版社,20O2,1081834 苗明三主编.实验动物和动物实验技术M】.北京 :中国中医药出版社,1997.269?基金项目:湖南省社会发展重大科技项目(99SSY100941)5 薛庆善主编.体外培养的原理与技术M】.北京:科学出版社,2001.5966MosmansTR.CherwinskiH.BondMW.eta1.T 帅 types0f 衄 helperTIlcl
10、one.I.Definitionaeconlingtopmfiloflymphokineactivitiesandse?cretedprotelnsJ】.JImmunol,1986.136(7J:2348 23577 陈慰峰主编.医学免疫学M】.北京:人民卫生出版社,20OO,92978PorterCM,ClipstoneNA.SustainedNFATsignalingproaTKIlikepatternofgeneexpressioninprimaryHnecD|TcellsJ.JImmund,2002,l68(10):49364945收稿日期:20030919l84JournalofCh
11、inesePhysician,February,2OO4,Vol6,No2改变,而表现为 95KD 蛋白质的磷酸化程度降低.那么在中国人非肥胖 2 型糖尿病患者中,又是哪种因素起主要作用呢? 本实验通过检测 2 型糖尿病患者红细胞膜上胰岛素受体数目和 8 亚基自身磷酸化程度,以探讨二者对 2 型糖尿病发病的影响.l 资料和方法1.1 一般资料 2 型糖尿病组:按 1999 年 WHO 诊断标准确诊的 2 型糖尿病患者 l4 例,其中男性 9 例,女性 5 例,所有患者均无糖尿病的急,慢性并发症,近期无感染,均做胰岛素释放试验分型.正常对照组:我院体检正常人 l2 名,其中男性 7 例,女性 5
12、 例.所有受试对象均无心,肝,肾等脏器疾病,近期未服降糖,降脂药物,均测身高,体重,计算 BMI.1.2 方法所有受试者禁食 12h 后清晨空腹抽肘静脉血 1OTnl,用肝素抗凝;另抽 2ml 血制备血清以测定胰岛素浓度,血糖.1.2?l 完整红细胞膜上胰岛素受体数目测定用放射配体结合法测定完整红细胞膜上胰岛素受体数目,胰岛素受体放射测定试剂盒由华西糖尿病研究所提供.实验过程严格按试剂盒说明书操作,根据各点特异性结合率(B/F)绘出 Scatchard 曲线,计算亲和常数及亲和位点数目.离制备红细胞,按 Comi 等【m所述方法制备膜蛋白,加或不加胰岛素(10.mol/L),4cI=孵育 18
13、h,加入磷酸化缓冲液(50mmol/LHEPES,0.1%TritonX 一 100.1mmol/LPMSF,12.5mmol/LMgC12,6mmol/LMnCI2.lmmol/LNa2VO4)和 7 一弛 PATP(比放射活性 5000Ci/mmol,购于北京亚辉生物医学工程公司),20C 水浴 20min.反应结束后,加入 Laemmlis 缓冲液 20/11 以终止磷酸化反应,取上清液点样进行不连续的垂直板凝胶电泳(0.1%SDS 一 7.5%PAGE,170V,4h)分离蛋白质,放射自显影后用激光薄层扫描仪测定凝胶各区带的吸光度.以加胰岛素与不加胰岛素测得 95KD 蛋白质的吸光度之
14、差,反映胰岛素受体 p 亚基的自身磷酸化程度,结果以每毫克蛋白质的吸光度代表(AA/mg 蛋白质).1.3 统计学处理所有结果以均数 4-标准差(王s)表示,经方差齐性检验后,用 t 检验检测组问差别,两指标关系以相关系数分析,用 MicrosoftExcel7.0 软件统计.2 结果2?l 受试者的一般情况 2 型糖尿病患者的年龄,BMI 与对照组无显着差异,但空腹血糖(FSG)与基础胰岛素水平(Fins)明显高于对照组.其胰岛素敏感指数 ISI 为一 5.274-0.35,显着低于对照组的一 3.924-1.22 红细胞膜胰岛素受体 p 亚基磷酸化测定分 O.35(PO.0001).表 1
15、 受试者一般情况完整红细胞胰岛素亲和位点及亲和力的比较(;4-s)注:与对照组比较 l=2.477,*PO.05.18.938,*PO.Ol;Ql,K1 分别为高亲和力住点数厦其亲和常数Q2.分别为低素和力住点数厦其亲和常数2?2 完整红细胞膜上胰岛素受体亲和位点及亲和力的比较按试剂盒提供的计算方法,根据每个标本各点的放射性,可计算出红细胞膜上高亲和力位点数目与亲和常数以及低亲和力位点数目与亲和常数(见表1).糖尿病患者每个红细胞膜上高亲和力位点数和低亲和力位点数分别为 214-13 和 9554-427,同对照组比较.两结果差异无统计学意义(P0.O5),其亲和常数(K.,K2)亦无显着差异
16、 (P0.o5)2?32 型糖尿病患者胰岛素受体 8 亚基磷酸化程度的比较与不加胰岛素相比,添加胰岛素后 95KD 蛋白质区带磷酸化程度均增加.已有证据表明,95KD 蛋白质的磷酸化可代表胰岛素受体 8 亚基的磷酸化?.因此,二者之差值可反映胰岛素受体的自身磷酸化.2 型糖尿病患者 B 亚基的磷酸化程度为(8.024-5.60)/XA/nag 蛋白,明显低于对照组(28.384-15.24)/xA/mg 蛋白(P0.005),其降低程度为 71.74%.2?4 胰岛素受体 B 亚基磷酸化程度与 ISI 的相关分析2 型糖尿病患者 95KD 蛋白质的吸光度与 ISI 的相关系数为 0.2002,
17、说明两者无显着相关性.3 讨论2 型糖尿病是一种常见病和多发病,其主要特点是胰岛素抵抗,表现为周围组织对胰岛素的不敏感,胰岛素的生理效应降低.从我们的结果可以看出,2 型糖尿病患者的基础胰岛素水平明显高于对照组,但空腹血糖亦较高,说明血糖的升高不是由于胰岛素量的绝对不足,而是胰岛素的生理效应降低.ISI(InsulinSemi.tireIndex)是反映胰岛素敏感性的一个指标 u,从结果可看出,2 型糖尿病患者的 IsI 明显低于正常对照组,亦反映 2 型糖尿病患者对胰岛素的敏感性降低,即存在胰岛素抵抗.中国医师杂志 2004 年 2 月第 6 卷第 2 期 l85In+.+.-!-一一 +.
18、+臼 95KD-jrLrjjl8C1617C1416?圈 1 正常人 ,2 型糖尿病人红细胞膜 INSR 磷酸化放射自显影图其中 C16,Cl4 为正常人,l6,l7,l8 为 2 型糖尿病患者2 型糖尿病胰岛素抵抗产生的原因可以是胰岛素受体数目的下降?d-.4J, 也可以是由于受体 p 亚基磷酸化程度降低 l-5J,且高糖和高胰岛素还可加重受体3 亚基磷酸化障碍 J,从而加重胰岛素抵抗.胰岛素受体位于细胞膜上,含有两个 a 亚基和两个 p 亚基,分子量分别为 135KD 和 95KD,胰岛素与受体的 a 亚基结合后,可使分子量为 95KD 的3 亚基的酪氨酸残基发生自身磷酸化 J,使其具有酪
19、氨酸蛋白激酶活性,进而激活多种酶促反应,最终引起胰岛素的生物学效应 JJ.胰岛素受体的自身磷酸化是信号传递的最早步骤,其磷酸化程度的改变将导致酪氨酸激酶活性的改变.本实验的研究结果显示非肥胖的 2 型糖尿病患者每个红细胞膜上胰岛素高亲和力受体和低亲和力受体数目与正常对照组无显着差异,其亲和常数亦无显着性差异,但其红细胞膜上胰岛素受体 8 亚基 95KD 蛋白质的磷酸化程度较对照组降低 71.74%(P0.005),说明中国人非肥胖的 2 型糖尿病患者,其病因可能与胰岛素受体结合力无关,而 p 亚基自身磷酸化程度的降低可能是中国人非肥胖型 2 型糖尿病胰岛素抵抗的致病因素.红细胞膜上胰岛素受体
20、B 亚基的自身磷酸化程度与 ISI 无明显相关,其原因可能有:(1)胰岛素的信号传递包括一个复杂的分子网络,信号传递中任一环节的障碍都可影响胰岛素的生理效应,产生胰岛素抵抗.已有证据表明,存在胰岛素抵抗的肥胖患者,其胰岛素受体和 IRSl,IRS 一 2 的磷酸化以及 3 一磷酸肌醇激酶(PDK)的活性均明显降低 l_9,说明胰岛素的抵抗程度并不只与其受体的自身磷酸化程度降低有关.(2作为衡量胰岛素敏感性的指标,ISI 具有一定的局限性.在以大样本的人群调查为基础的研究中,其准确性较好,但在较精细的小样本研究中则不如葡萄糖钳夹技术及最小数学模型一 13J.本实验样本数少,因此以ISI 粗略估计
21、胰岛素的敏感性.本实验结果提示:与正常对照组相比,中国人非肥胖型 2 型糖尿病患者红细胞膜上胰岛素受体的数目及亲和常数并无显着差异,表明受体数目及亲和力的改变不是非肥胖 2 型糖尿病患者的致病因素;2 型糖尿病患者红细胞膜上胰岛素受体 p 亚基的自身磷酸化程度较正常对照组下降 71.74%(P0,005),说明该磷酸化程度的降低正是中国人非肥胖型 2 型糖尿病的致病因素.参考文献1KahnCR.CausesofinsulinresistanceJ.Nature.1995,372:l28 一 I292SaltielAR,KahnCR.Insulinsignallingandtheregulati
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