1、浅述酶底物法快速测定地表水中总大肠菌群与大肠埃希氏菌摘要：根据生活饮用水卫生标准中对微生物指示菌检测的方法要求，提出采取精确、快速、可靠的总大肠菌群及大肠埃希氏菌检测方法，通 过试验方法对比、实际水样检测，比较酶底物法与多管发酵法、 滤膜法用于生活饮用水地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测结果。实验结果表明，酶底物法能够快速检测地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌，结果精确、快速、可靠，并认为在控制流行疾病的发生传播，从而保障公众健康安全有重要的预报价值和科学意义，同时鉴于我省大多数自来水公司的水质检测还没有增加此方法,建议今后该方法应得到普及和应用。关键词：总大肠菌群；大肠埃希氏菌；酶底物法我
2、国新的国家生活饮用水卫生标准 （GB 5749-2006）中对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生评价时，总大肠菌群（Total coliforms）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是判定水质是否被粪便污染的两个重要指标，尤其是大肠埃希氏菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。新的国家生活饮用水卫生标准中加入大肠埃希氏菌指标，限值为 100mL 不得检出大肠埃希氏菌。并注明：若检出总大肠菌群，必须进行耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。若水样中检出耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌，则说明水质可能受到严重污染，必须采取相应措施。目前，新国标中对总大肠菌群和大肠埃
3、希氏菌的测定有三种标准方法，多管发酵法、滤膜法和酶底物法，其中多管发酵法和滤膜法是目前常用的传统检测方法，这两种方法设备简单，试验步骤较为繁琐，对操作人员专业水平要求较高，不利于应急检测，和对水的卫生学状况做出快速评价。酶底物法检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌具有操作方便、快速；干预性结果容易判断等特点，适用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的快速检测，对于及时准确的监测饮用水、地表水和水源水粪便污染状况，从而有效预报和控制流行疾病的发生与传播有重要意义。本文分别采用国标中的二种检测方法对地表水中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌进行检测，通过比对，得出酶底物法不仅适用于地表水检测，还适用于应急检测，易于
4、推广，可以较好的弥补传统方法的不足。1 实验部分1.1 总大肠菌群和大肠埃希氏菌快速检测法原理酶底物法是指在选择性培养基上能产生 -半乳糖苷酶（-D- galactosidase）的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，同时能产生 -葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法。 1.2 主要设备和试剂（1）设备100mL 稀释瓶（能耐高压的灭菌玻璃瓶） ；1mL、10 mL 移液管或移液枪；生化培养箱 （361） ；高压灭菌器；爱德士（IDEXX）定量
5、培养用无菌塑料定量盘；爱德士（IDEXX）程控定量封口机；6W 波长 365nm 的紫外灯。（2）试剂培养基：MMO-MUG，该实验固定底物技术所需的 MMO-MUG 培养基采用市售科立得（Colilert）商品化制品。生理盐水： 8.5g/L 用于稀释样品。1.3 方法步骤1.3.1 水样采集和稀释检测水样需 100 mL.如果水样污染严重，可对水样进行稀释。用灭菌后的无菌玻璃管取 10 mL 水样加入到 90 mL 灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。1.3.2 定性反应（1）用 100 mL 的无菌稀释瓶量取 100 mL 水样，加入一瓶科立得（Colilert）成品 MMO-MUG 培
6、养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。（2）在 361 培养箱中培养 24 小时。（3）根据表 1 的说明判断定性检测结果。表 1 定性判读结果比阳性比色对照品的黄色浅 总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴与阳性比色对照品的黄色相近或更深 总大肠菌群为阳性与阳性比色对照品的黄色相近或更深且在紫外灯下显荧光总大肠菌群、大肠埃希氏菌为阴性1.3.3 定量分析（1）用 100 mL 的无菌稀释瓶量取 100 mL 水样，加入 MMO-MUG 培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。见图 1。（2）将前述 100mL 水样全部倒入 51 孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡。见图 2.（3）用爱德士（IDE
7、XX）程控定量封口及封口后，在 361 培养箱中培养 24 小时。见图 3.（4）根据定性结果，数出阳性格子数后对照 MPN 表得到定量检测结果。见图 4。图 1 图 2 图 3 图 42 实验结果与分析2.1 实验结果的判读将水样培养 24h 后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到 28h 进行结果判读，超过 28h 之后出现的颜色反应不作为阳性结果。2.2 实际水样检测结果本次实验分别采集三个不同地方的地表水进行同一方法（酶底物法）平行比对，不同方法（酶底物法和多管发酵法）比对实验，具体结果如下： （1）地表水水样平行检测结果（酶底物法）选取三个不同地表水源水样采用酶底物法进
8、行多次平行检测，具体检测结果见表 2。表 2阳性数 阳性数地点 样品 100mL 50mL总大肠菌群MPN/100mL 100mL 50mL大肠埃希氏菌结果MPN/100mL地表水 A1 11 6 11 0 0 0地表水 A2 10 6 10 0 0 0地表水 A3 12 5 11 0 0 0地表水 A4 11 5 11 0 0 0地表水 A地表水 A5 9 5 10 0 0 0地表水 B 1 7 4 9 0 0 0地表水 B 2 9 5 10 0 0 0地表水 B 3 9 4 10 0 0 0地表水 B 4 9 4 10 0 0 0地表水 B地表水 B 5 8 5 9 0 0 0地表水 C
9、1 51 47 260 6 3 6地表水 C 2 51 49 330 9 5 10地表水 C 3 51 48 290 9 5 10地表水 C 4 50 45 220 6 3 6地表水 C地表水 C 5 51 48 290 7 4 8（2）同一水样不同检测方法比对（酶底物法和多管发酵法）选取同一地表水源水样进行酶底物法和多管发酵法进行方法比对试验，具体试验结果如下图 5、图 6。图 5图 6总 大 肠 菌 群 检 测 结 果01002003004001 2 3 4 5 6 7 8 9 10样 品 编 号检测结果（MPN/100mL） 酶 底 物 法多 管 发 酵 法大 肠 埃 希 氏 菌 检 测 结 果0246810121 2 3 4 5 6 7 8 9 10样 品 编 号检测结果（MPN/100mL） 酶 底 物 法多 管 发 酵 法2.3 结果分析和讨论对酶底物法平行测定结果进行统计学分析，对酶底物法和多管发酵法测定地表水样两组结果进行 T 检验，当置信度为95%时，对照 t 值表 t= ,而 t 计 值= ， ，结果 t 计 t，检验结果说明两种方法不存在显著性差异。3 结语
