1、Hoechst 染色:hoechst 可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞) 在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst 染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有 hoechest33342 和 hoechst33258 两种 hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是 hoechst33342 对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258 用于细胞固定后再染色，而 hoechst33342 则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide 碘化丙啶)染色: 是一种可对 DNA
2、 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用 PI 单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡 PI 亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么 PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么 PI 单一染色显然不够！annexin-v 染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变 .其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,
3、Annexin-V 在 Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V 结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V 用 FITC 标记发绿色荧光；如果用 PE 标记就发红色荧光。JC-1 染色 JC-1 是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer) 存在，发射光以绿光(525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光 (-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polariza
4、tion)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由 Ca2+、Na +和 H+流调控。当线粒体状态良好时对 JC-l 摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化 (depolarization)时，线粒内 JC-l 的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1 染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1 染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。JC-
5、l 染色非常简单。首先可将成品 JC-1 以 DMSO 配成储存液(15mg/ml)，储存于-20 ，用时以培养液稀释至 10ug/ml 终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min 后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。 钙黄绿素-AM(Calcein-AM):Calcein -AM 本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM 能脱去 AM 基，产生的 Calcein 能发出强
6、绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此 Calcein -AM 仅对活细胞染色细胞活力鉴定台盼蓝染色法原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的 DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。用品：1. 4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤，4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%。2. 吸管、血细胞计数板、显微镜步骤：1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 6 细胞/ml）2、染色：细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀。3、计数：在三分钟内，用计数板分
7、别计数活细胞和死细胞结果统计：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+ 死细胞总数）100注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。台盼蓝染色原理通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。试述台盼蓝染发鉴别死活细
8、胞的原理，试分析染色时间过长本来是活细胞也被染色的原因 死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。方法 特点 染细胞类型 染色部位 激发光 颜色 意义Hoechst 染色 活细胞(主要是早期凋亡细胞)细胞核 紫外激发 核染蓝色 检测早期凋亡PI 染色 坏死细胞或凋亡晚期细胞细胞核 绿光激发！ 核染红色 检测死细胞或凋亡晚期细胞annexin-v 染色 早期凋亡细胞 细胞膜 不定 不定 早期凋亡灵敏指标JC-1 染色 早期凋亡细胞 线粒体膜 绿光为主 功能好的细胞绿色为主反之红为主早期凋亡台盼蓝染色 死细胞 降解 DNA ? 蓝色 细胞存活率Calcein-AM 染色 活细胞 ? 绿荧光光 黄绿色 活细胞数
