1、LipofectamineTM 2000CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75mlCAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml 4储存（不要冻存）说明：LipofectaminTM 2000 是核酸（DNA 或 RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点： 对各种细胞及细胞板（如 96 孔板）都有高的转染效率，在 的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。 在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- LipofectaminTM 2000 复合物能够直接加给细胞。 在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养 4-6 小时后需要除去
2、复合物。关于转染的一些重要建议：1. 不要用即将要介绍的转染程序进行 RNAi 的转染实验。在 对于大多数细胞系，转染复合物中 DNA(g)与 LipofectamineTM 2000(l)的比例在 1：2 到 1：3 之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062） （reduced serum medium）稀释LipofectamineTM 2000 和 DNA.3. 为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为 90%-95
3、%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。4. 为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。5. 由于一些无血清复合物（如 CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和 LipofectamineTM 2000 的相容性。转染步骤（用于 DNA）：按照如下步骤在 24 孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。1. 贴壁细胞：转染的前一天，在 500l 无抗生素培养基中接种 0.5-2105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到 90%-95%。悬浮细胞：在准备转
4、染混合物时，每 500l 无抗生素培养基中含有细胞数量为 4-8105。2. 对于每个转染样品，按下面的方法准备：a、 在 50l 无血清 Opti-MEM I 低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA，并轻轻混匀。b、 使用前轻轻混匀 LipofectamineTM 2000，然后取相应的量稀释在 Opti-MEM 培养基中。室温下静置 5 分钟。注意：要在 30 分钟内混合 LipofectamineTM 2000 和 DNA的稀释液。c、 室温下静置 5 分钟后，混合 LipofectamineTM 2000 和 DNA 的稀释液（总体积为100l） 。轻轻混匀并在室温下静置 2
5、0 分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊） 。注意：混合物在室温下的 6 个小时内不会失效。3. 细胞板的每个孔中加混合液 100l，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。4. 检测目的基因的表达情况前，细胞于 37 CO2培养箱中培养 18-48 小时。此时不需要改变培养基，但 4-6 小时后也许需要更换.5. 对于固定的细胞系：转染 24 小时后将细胞以 1：10（或更高的稀释度）稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话，在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。对于悬浮的细胞系：转染 4 小时后，如果需要，加入 PMA 和/或 PHA 以提高 CVM 启动子的活性并促进基因表
6、达。转染量度标准：在不同的组织培养板中转染细胞时，根据相对的表面积，按比例加入 LipofectamineTM 2000、细胞、和培养基，具体情况剪下表。在自动、高产率体系中，建议 96 孔板的转染混合物的体积为 50l。注意:操作时，可以直接将细胞混入转染混合物中进行快速的 96 孔板转染。在细胞板中准备好转染混合物，然后直接加入说明中正常 100l 体积时浓度的 2倍浓度细胞培养液。在转染混合液存在情况下，细胞可以正常的贴壁。培养容器 每个孔的表面积（cm 2）相对于 24 孔板的表面积铺板培养基体积DNA(g)/培养基（l）LipofectamineTM 2000（l）/培养基（l）96
7、 孔板 0.3 0.2 100l 0.2g/25l 0.5l/25l24 孔板 2 1 500l 0.8g/50l 2.0l/50l12 孔板 4 2 1ml 1.6g/100l 1.0l/100l35mm 板 10 5 2ml 4.0g/250l 10l/250l6 孔板 10 5 2ml 4.0g/250l 10l/250l60 mm 板 20 10 5ml 8.0g/0.5ml 20l/0.5ml10cm 板 60 30 15ml 24g/1.5ml 60l/1.5ml注意：表面积是根据培养容器的实际测量得到，但也会根据容器生产商的不同发生变化。优化转染：为了得到高的转染效率和低的无用副效应，通过改变细胞浓度、DNA 以及LipofectamineTM 2000 的浓度来优化转染条件。另外，要保证细胞培养基的细胞混浊度高于90%，DNA(g) 与 LipofectamineTM（l ）2000 的比例在 1：0.5 到 1：5 之间。
