1、口蹄疫研究进展,江西农业大学动物科技学院 何后军 教授 联系电话：0791-3813149 E-mail: ,主要内容,口蹄疫（FMD）概述 口蹄疫（FMD）病毒 口蹄疫（FMD）难以控制和根除的原因 口蹄疫（FMD）的流行特点 目前口蹄疫（FMD）疫苗的应用风险 口蹄疫（FMD）流行毒株与疫苗毒株的生物特性 口蹄疫（FMD）的综合性防控措施 口蹄疫（FMD）的研究热点,口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。,蹄
2、部病变蹄客脱落,母猪乳头水疱,口蹄疫概述,人对FMD病毒的感受性极低，即使感染也属良性或无症状经过、且多为幼龄儿童。FMD可导致巨大的经济损失，引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，此外由于贸易的限制和禁止动物及其产品的出口而引致的损失更大，全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元，所以FMD在国际上被称为“政治经济病”，历来受到各国政府的重视。国际兽疫局(OIE)将FMD列为动物卫生法典中的A类疫病之首。鉴于此，“无FMD国家和地区”投入巨大成本根除此病并维持其地位，而许多有疫国家则投入巨资执行其控制和扑灭根除计划。,口蹄疫概述,近两年来，我国周边的部分国家
3、和地区连续发生口蹄疫，其流行之广，损失之大，令人震惊。从口蹄疫的地理分布态势可见，我国东与爆发疫病的日本、韩国和中国台湾隔海相望，南与疫情常年发生的越南、缅甸陆路相通，北与疫情复杂的俄罗斯、蒙古比邻而居。从所存在的病毒血清型种类、病毒存储和变异的自然环境，以及社会、经济等方面的诸多因素来综合分析。更大的威胁来自位于我国西南的有“口蹄疫毒库”之称的印度和西北的“病毒通道”中亚数国。这些接壤国家的A、C、Asial等毒型和众多的O型变异株随时都有可能侵入我国，并可能造成大的流行。,口蹄疫概述,在感染了口蹄疫病毒的细胞培养液中，有大小不同的4种粒子。最大的粒子为完整病毒，其直径为2312nm，沉降系
4、数为146S，具有感染性。第二种为不含RNA的空衣壳，其直径为21nm，沉降系数为75S，无RNA，无感染性，有型特异性和免疫原性。第三种为衣壳蛋白亚单位，其直径为7nm，沉降系数为12S，无RNA，无感染性，有抗原性。第四种为病毒感染相关抗原(VIA抗原)，沉降系数为4.5S，是一种不具有活性的RNA聚合酶，当病毒粒了进入细胞，经细胞蛋白激活才有酶活性，能诱发动物产生特异抗体，无型特异性，而有群特异性。,口蹄疫病毒,口蹄疫病毒目前有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、 2、3型)及AsiaI(亚洲I型)等7个血清型。在A、O、C三个血清型中似乎以O型最常见。各型间彼此几乎没有
5、交叉免疫性。但各型在发病症状方面的表现却没有什么不同。每一个血清型又分若干个亚型，同型各亚型之间仅有部分交叉免疫性。据最新报道，口蹄疫亚型已增加到70个以上。 进入80年代后，对新亚型不再编号，甚至到目前已不再强调亚型的鉴定，只强调新的分离物与疫苗株进行比较，以便正确选择疫苗种毒。,口蹄疫病毒,欧洲流行、个型；亚洲主要流行、和Asia型，中东地区少数国家也流行SAT型；非洲口蹄疫具有不同的特点，毒型众多，疫情复杂，不仅有、个型，还有独特流行于非洲南部各国的SAT-、SAT-和SAT-个型；南美洲流行、个型。 目前在我国内地发生的4起口蹄疫疫情属亚洲型。,口蹄疫病毒,口蹄疫病毒基因组结构,口蹄疫
6、病毒基因组结构,L-蛋白是FMDV中的一种毒力因子。 Poly(C)的长短因毒株不同而有很大的差异，可能与病毒的毒力有关。 Poly(A)尾巴与病毒的感染性有关，Poly(A)越长感染性越强。 VP1蛋白大部分暴露在病毒的表面，是决定病毒抗原性的主要成分。VP1的第141160位和200213位氨基酸残基是FMDV的主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体，也是抗原性的高变区。分析该高变区不仅对FMDV遗传变异的研究具有指导意义，而且对FMD流行病学的研究以及新型疫苗的研制也很重要。一般认为，FMDV衣壳蛋白VP1上的RGD序列是细胞表面受体的配体，是FMDV侵染细胞所必需的。VP1蛋白的G-H 环
7、具有识别受体及中和抗体互相作用的双重功能。 VP4与诱导产生中和抗体有关。 2C 可能与RNA 的复制有关，2B与病毒的感染谱有关。,口蹄疫病毒基因组结构,FMDV- Structure,G-H loop,VP2,VP1,VP3,口蹄疫病毒与其他动物病毒不同的特点之一就是它的互不免疫的血清型。每个血清型又有很多亚型，1977年世界口蹄疫中心公布口蹄疫病毒有7个血清型和65个亚型，每年还会有新的亚型出现。（多型性、易变性、互不免疫性） 各型之间在临床表现方面没有什么不同，但彼此间无交叉免疫性。 同型各亚型之间交叉免疫程度变化幅度较大，亚型内各毒株之间也有明显的抗原差异。,据FMD世界咨询实验室对
8、20002003年送检病毒株的鉴定报告，本世纪最初4年全世界流行的FMD主要为。O、A, Asial, SAT1和SAT2型。其中鉴定为O型的占发病国家和地区的63.9%( 39/61) ,A型为13.1 % ( 8/61) , Asial型为9.8% (6/61) , SAT1和SAT2型均为6.6% (4/61)。但特别值得关注的是：南非独特流行的SAT2型己传至中东的科威特和沙特(2000年);亚洲独特流行的Asia I型已传至欧洲的希腊、土尔其(2000年)和格鲁吉亚(2001年)。,猪的口蹄疫,猪的口蹄疫,人FMD,FMD的易感动物种类多，而且重要经济畜种猪、牛、羊都易感； FMDV
9、基因组具有小RNA病毒准种的特性，病毒变异性极强，有七个血清型，型间不能交叉免疫，免疫防控等于面对七种不同的传染病。型内不同病毒株间的遗传变异可导致抗原差异，新变异株的出现，就会导致一次新的疫情流行；,口蹄疫难以控制和根除的原因,FMD病毒的感染性和致病力特别强。由于FMDV主要经由吸入、摄入、损坏的上皮和治疗途径感染，感染动物能从多种途径分泌/排泄出大量病毒，散布到环境中的病毒相对来说又有较强的抵抗力和存活力，而少量病毒就会引起易感动物感染。例如，牛只要吸入10个感染单位就可发病，而病畜的排毒量又特别大，病猪每天仅从呼吸道排出的病毒就高达108个感染单位。也就是说，一头病猪一天呼出的病毒如全
10、被牛吸入，可使1千万头牛发病。,口蹄疫难以控制和根除的原因,FMD有多种传播方式和感染途径，不但与感染动物(最频繁的传播方式)、污染的动物产品、人员、污染物及装置的(直接或间接)接触是FMD最主要的传播途径，还可通过气溶胶经空气远距离传播，但并不常见，只有在适当的气象和地理条件下，空气向下风方向的远距离(几十甚至上百公里)传播才可能起着重要的作用； FMD的潜伏期短，发病急，动物感染病毒后最快十几小时就可排毒发病；,与其它动物病毒相比，动物机体对FMD病毒的免疫应答程度较低。免疫注射动物，甚至发病后康复动物，再次受到同源病毒攻击时有可能只保持临床不再发病，但其免疫系统不能完全阻断病毒感染。被F
11、MD病毒感染过的反自动物或少数接种动物会成为不表现临床症状(持续感染)或亚临床感染(进一步传播病毒的风险很低)的带毒动物。在不能屠宰所有发病和同群畜的情况下，带毒动物就可能是一个潜在的、引发未来疫病暴发和在流行病学方面有重要意义的病毒传染来源。,病毒的特性发生改变，出现优势毒株FMDV的7个血清型，抗原性各不相同，并且每一个单独的血清型病毒都可以引起口蹄疫的暴发。研究显示口蹄疫病毒的7个血清型在全世界并不是均匀分布，其中O型分布最广，占76%，而居首位，也是引起口蹄疫暴发流行的主要血清型；口蹄疫病毒有很强的变异性，在不断流行与暴发中， 病毒也随之发生不断变异， 而在变异中病毒的遗传特性和生物学
12、特性必然也会发生一系列的改变。其中最显著的改变就是病毒出现了对宿主异嗜性的变化。偶蹄动物对口蹄疫病毒都是易感的，但是在1997年3月台湾暴发的口蹄疫却只有猪发病且出现明显的临床症状，而与猪接触甚至人工感染的牛都不出现临床症状；,口蹄疫的流行特点,另外，2000年韩国暴发的口蹄疫也只有牛发病，而 2002年再次暴发时却主要为猪发病。病毒的这种宿主异嗜性的改变，给今后预防工作带来很大的困难，那些不表现临床症状的动物很可能是隐性感染，而成为今后暴发的传染源。 O型病毒的泛亚株是一个新出现的具有较强的传播能力和能力的病毒株。泛亚株的宿主范围很广，包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼、鹿和羚羊等。该病毒的猪体
13、适应株与其他血清型共存。口蹄疫病毒的 VP1基因是突变率比较高的位点，而泛亚株却相对稳定，对11年中不同的泛亚毒株 VP1基因的核苷酸序列进行的比较发现它们的差异不到5%。泛亚株对不同的动物在临床上表现了不同的致病。在伊朗引起羔羊很高的致死率，在中国台湾省和日本却引起牛的亚临床感染，在 2001年英国流行中，对绵羊的感染较温和的症状，给兽医的诊断造成了很大的困难，延误了疫情的控制而使病毒大量的扩散，形成了世界范围的大流行，而且该毒株对猪的潜伏期可由通常的 210d缩短至 36 h。,泛亚株具有明显的竞争优势，是造成 2001年世界口蹄疫大流行的罪魁祸首，给各国造成了不可估量的损失。因此 泛亚株
14、已经成为目前世界口蹄疫的优势毒株。 亚洲型口蹄疫是新传入中国的急性、烈性传染病，主要感染牛、猪、羊等偶蹄类动物，不属人畜共患病，对人的健康和安全不会造成威胁。,病毒传播速度加快，造成的危害更大口蹄疫病毒具有极高的传染性，并且能通过空气、旅行和食品等传播。易感动物也可以通过多种方式感染病毒，如消化道、呼吸道等途径。由于病毒的不断的演化而出现的竞争优势毒株具备更强的入侵能力和更好的适应环境变化的能力，能冲破国际防疫屏障，实现跨国传播，造成范围更广的口蹄疫的暴发。2000年3月韩国、日本相继报道暴发口蹄疫，而仅1个月后，病毒就进入了俄罗斯、蒙古引发两国的口蹄疫暴发。2001年2月英国暴发口蹄疫是19
15、68年后的再次暴发，并且也是只经过了1个月，病毒就扩散到了北爱尔兰、爱尔兰、法国和荷兰等国家，造成了欧洲乃至整个世界口蹄疫的大暴发。,泛亚株较强的环境适应性及入侵能力 , 能在很短的时间内造成大范围的流行，因此而造成的损失也是无法估计的。1997年台湾暴发口蹄疫造成的经济损失约为136亿元新台币， 而对外贸易的损失近1, 000亿新台币。2001年英国口蹄疫造成的损失是史无前例的，此次流行中仅在英国就宰杀了5 920 419头动物，加上欧洲其他国家至少要有630万头的动物要被宰杀。这次口蹄疫的流行造成的直接经济损失有27亿英镑，另外由于此次口蹄疫也严重影响了英国旅游业，使英国减少了约25万个就
16、业的机会，从 2001年2月到10月仅8个月的时间，英国的旅游业就损失了33亿英镑。据ULRBC (英国皇家商品公司 ) 称自2月份口蹄疫暴发至 11月底， 他们共损失了约51亿英镑。另有人估计，这次流行给英国的间接损失可达200亿英镑， 这相当于英国国内生产总值 (GDP)的215%。山东省泰安市岱岳区、江苏省无锡市惠山区、新疆和布克赛尔县和北京市延庆县相继发生四起亚洲I型口蹄疫疫情，4383头病牛及同群牛已全部扑杀，疫情已得到有效控制。中国政府将对每只被捕杀的牛给予4000元到6000元人民币的补偿。,非口蹄疫国家重新暴发口蹄疫1991年欧盟开始对口蹄疫实施了不免疫政策，到1997年欧盟已
17、经无口蹄疫。2000年5月24日。OIE国际委员会通过了54个国家为非免疫无口蹄疫国家，其中欧洲就占了32个，美洲12个、 亚洲4个、大洋州4个、非洲2个。但由于口蹄疫是变异性很强的病毒，病毒突变株的广泛存在以及感染宿主的广泛性和环境因素的复杂性，使疫情的暴发往往不可预测并且难以控制。事实也证明，对口蹄疫来说，破坏力最大的时候就是在以前无病毒存在的区域或者是一个血清型进入一个新的地区的时候。1997年中国台湾2000年韩国、日本以及2001年的英国的口蹄疫疫情就是变异株在原为无口蹄疫国家重新大规模暴发的最好例子。,韩国和日本都是亚洲的岛屿国家， 对外来病毒的传入有天然屏障的优势， 加上两国都有
18、严格的出入境检疫政策， 因此在1908年 (日本 )、1933年 (韩国 ) 就已经消灭了口蹄疫，使其成为了亚洲少有的无口蹄疫国家。但是2000年3月两国都暴发严重的口蹄疫，蒙受了巨大的经济损失。而2001年英国的口蹄疫也开始流行，这是自1981年以来首次大暴发，据英国报道，此次流行怀疑可能是由英威尔特郡波顿镇的一个实验中心保存的一只盛有口蹄疫病毒的试管被人偷走而引起的，另外英国口蹄疫专家詹姆斯博士认为，从病毒类型来判断造成流行的疫源可能是由南非走私的肉制品而制成的猪饲料。,目前市面上FMD疫苗在各血清型的交叉保护性很低。他们分別是由对抗FMDV的七种亚型：A、O、C、Asia1、SAT1、S
19、AT2及SAT3所制成的。这些疫苗皆是经由幼仓鼠肾传代细胞培养增殖而得的病毒液。这些疫苗所引起的免疫反应都是针对特殊亚型，为了反映最新分离的野毒株，這些产品必须常常重新更新。此外，由于这些病毒很有可能会从生产工厂中流露出来和具有去活化不完全的危险，所以生产及使用不活化病毒疫苗都是具有危险性的。由于后者的危险性，接种疫苗的国家要出口牲畜及动物产品到口蹄疫非疫国是禁止的。 受FMDV感染而恢复的猪有一年或至更久的免疫力，可保护他们避免受到同种病毒的感染，但并不是终身保护。,目前口蹄疫疫苗应用风险,利用目前的疫苗来控制口蹄疫有几点困难：(1) FMDV具高度传染性；(2)病毒抗原性具多样性及变异性；
20、(3)感染或接种疫苗后，免疫期短；(4)接种疫苗及自然感染动物的分辨。然而，目前不能只靠免疫计划来清除口蹄疫。基于这个理由对于分辨非感染、接种疫苗、和自然感染的动物而言就相当重要。 由于长期应用疫苗，在免疫选择压力的作用下，病毒变异速度加快。 FMDV混合种(quasispecies)的存在，导致持续感染。,认为 FMDV 病毒种群不是由一种定义的分子种群组成的，而是由一种或几种在基因组中占优势的少数显性主序列(master sequence)和一些不相同但相关的分子种群构成的。Domingo 认为，从持续感染牛体分离的持续感染毒株的变异性可通过RNA基因组种群动态分布模型得到完美的解释。即在
21、机体内每一个变异株都与其他的突变株竞争突变以达到在种群分布的优势地位。在长期的进化过程中，变异基因组受到宿主正向选择压力的影响，也受到一个或几个感染颗粒从一种感染宿主传播到另一种敏感宿主的随机性的影响。这些突变的病毒株就可以逃避原毒株已诱生的体液和细胞免疫，导致病毒的持续性感染。,宿主体液免疫和/或细胞免疫对病毒直接选择可能导致病毒抗原变异。 不科学免疫防控造成免疫选择压力（免疫质量不佳密度不够或群体抗体水平低下或不整齐导致半免疫状态形成免疫压力筛选造成病毒变异） 半免疫状态：是指机体的抗体水平不足以彻底清除侵入的病原而与其呈一种动态平衡关系的状态。,造成上述状态的主要原因有以下诸方面： 免疫
22、时机不科学 如无免疫监测指导的免疫接种致疫苗毒中和原有处于保护界值以上较高水平的抗体； 疫苗选择不当或免疫方法不科学 前者如FMD出现地方亚型株但择苗时并非此型（苗不对型），后者如使用质量没保证的非法生产FMD疫苗或接种量不足或空注等。 免疫抑制性疫病的影响 如CSFV、PRV等。 消毒和清洁卫生管理不佳或缺乏 造成饲养环境中病原密度过大（超过机体最大免疫抗病水平的承受能力）。,此种状态和临界免疫状态可形成一种强大的免疫压力，致使病原发生以下变化： 组织嗜性或宿主群逐步变宽； 病原发生变异出现亚型毒株； 病原毒力变强出现所谓的超强毒株。 从生物学的角度看，实质上这是病原体与其宿主动物体两者相互
23、作用而逐渐选择适应的必然结果，是病原体适应环境生存的一种进化表征。,口蹄疫流行毒株与疫苗毒株 的生物学特性,口蹄疫病毒对细胞与实验动物的适应性 口蹄疫病毒可在牛舌上皮细胞、甲状腺细胞、牛胎皮肤-肌肉细胞以及猪和羊胎肾细胞、胎兔肺细胞、仓鼠肾细胞内增殖，并常引起细胞病变（CPE），其中致猪肾细胞的CPE较牛肾细胞更明显，犊牛甲状腺细胞对口蹄疫病毒极为敏感，并产生极高效价的病毒。BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞系亦被广泛用于口蹄疫病毒的增殖。但口蹄疫病毒在细胞上的增殖能力在各毒株间存在很大差异。Nair在1987年比较了口蹄疫病毒 Asia I 型的野外分离毒株Mukteswar，Bl、B2
24、与制苗毒株Asia I 63/72在BHK-21细胞上的生长状况、空斑大小、补体结合抗原滴度、病毒产生的CPE、抗原特性及免疫原性的差异，结果发现Asia I 63/72与Bl毒株能很好地适应细胞，病毒稳定地扩增，于接毒l0-l2h即可产生100%的CPE。用这2株病毒制成疫苗免疫6月龄以上的动物几乎无不良反应，免疫原性很好，而Mukteswar及B2对BHK-21细胞的适应性不如Asia I 63/72和Bl毒株。,口蹄疫流行毒株与疫苗毒株是生物学特性,近年来的研究认为，口蹄疫病毒极其保守的RGD序列在病毒与细胞结合中起重要作用。口蹄疫病毒与敏感细胞表面受体特异性结合后形成特异性吸附，而病毒
25、结构蛋白VP1的G-H环上的RGD序列是病毒与细胞结合所必须的，但口蹄疫病毒侵染宿主细胞是个很复杂的过程，详细机制仍在研究中。 此外，Carillo等研究发现，口蹄疫病毒A-24毒株在体外抗体压力下，获得了与弱毒突变株相同的表型性状，由此看来，弱毒株的突变在疫苗制造上是一个极大的潜在性危险。目前已有人将反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)应用于检测口蹄疫病毒RNA在体外条件下在牛皮肤郎罕氏细胞上的增殖，用该方法将有助于进一步了解口蹄疫病毒在组织培养细胞上的增殖。 总之，病毒的复制与扩增取决于某个型的口蹄疫病毒在组织培养细胞上的适应状态，若病毒能很好地适应该细胞就能很好地复制，反之则否。若病毒能
26、很好地适应细胞并大量扩增，用此病毒制造疫苗，就能获得免疫原性好的保护性抗原，疫苗的免疫效果就会提高。,血清学特性应用补体结合试验、琼脂扩散试验、交叉保护试验和ELISA可进行口蹄疫病毒型的鉴定；亚型的鉴定主要是根据各毒株间的血清学关系，按测出的关系值(r)或亲缘值(R)区分型或亚型。鉴定亚型的目的主要是用于流行病学研究和寻找适合的疫苗毒株。一般认为，区分亚型时主要应考虑r值，且应该与特定的参考毒株进行系统的比较。 在无口蹄疫地区暴发口蹄疫或出现免疫预防失败时，亚型的鉴定是确定该暴发是否是因为流行毒株出现新的抗原特性的依据。目前，虽然血清学分析测定R值比较繁锁，而且花费时间长，但仍不失为一种经典
27、的方法。通过抗原捕获RT-PCR鉴定口蹄疫病毒血清型，特异性好、灵敏度高、简便快速。利用装有型特异性抗体的微量离心管，从临床材料中捕获口蹄疫病毒，通过RT-PCR扩增病毒序列大大提高了口蹄疫病毒血清型鉴定及检测的敏感性和特异性。随着现代诊断技术的发展，将RT-PCR与核酸序列分析相结合的核酸序列分析方法在口蹄疫病毒研究中得到日益广泛的应用。从以上分析可以看出，欲成功地控制或扑灭某次疫情，必须了解其疫源，而仅仅在型或亚型水平上的判断是不够的。核苷酸序列分析可发现存在于基因水平而不引起氨基酸改变的微小差异，从而更清楚地揭示流行的起源和过程，防止疫情再次暴发。,分子生物学特性 *毒株的抗原结构：口蹄
28、疫病毒由1分子的单股正链RNA和60个亚单位的4种蛋白质VP1VP4组成，VP1具有免疫活性，与146S完整病毒颗粒相比，大多数VP1制剂的免疫活性都较低。对口蹄疫病毒免疫原性肽抗原位点的预测揭示，136一160位氨基酸的肽段具有抗原活性，141160肽段的免疫活性最强，其它肽段的活性仅有该肽的1左右。VP1蛋白的2个序列，141l60和200213能激发中和抗体应答，虽然2种抗肽血清对146S完整病毒粒子有相似的ELlSA效价，但抗141160血清的中和活性比抗200213血清的高100倍。,*口蹄疫病毒的变异：口蹄疫病毒的变异是由于VP1蛋白上主要免疫原性的氨基酸被替代，分析该高变区不仅对
29、口蹄疫病毒遗传变异的研究有指导意义，而且对口蹄疫的流行病学研究以及新型疫苗的研制也很重要。口蹄疫病毒A22亚型是定期用作疫苗毒株的4种流行毒株之一，有特殊的抗原结构，其抗原性与其他疫苗毒株及其它A型毒株相差很大。体内和体外试验研究了A22亚型VP1蛋白的多肽结构，发现Pa1m-135-158-GAA-170-198(ACM)多肽能诱发有效的抗病毒保护。该多肽也包括了B细胞和T细胞的抗原表位。此外，该多肽结构不仅包括口蹄疫病毒的VP1蛋白135138的主要抗原位点，而且也包括在VP1序列170180之间的病毒特异的T细胞辅助表位，该结构比以前描述过的Palm(2)135159短肽具有更好的抗病毒
30、保护性、免疫原性和T细胞增殖反应性。170一180位作为病毒特异的T细胞表位，负责增强该多肽的免疫原性。,目前，抗原位点研究较多的是O、C和A型，其中研究最深入的是O型抗原位点，其它各型口蹄疫病毒抗原位点的报道较少。O型口蹄疫病毒至少有5个中和性抗原位点，其中有3个位于 VP1上。特别是抗原位点1，它由VP1的G-H环(141l60位残基)和C端200-213位残基组成。VP1的这2个区域在决定病毒的抗原性和免疫原性方面起主要作用，故抗原位点1是口蹄疫病毒最重要的抗原位点。另外VP1作为主要的免疫原性蛋白，集中了大多数的病毒中和抗原位点。还有一些形态表位位于结构蛋白VP2和VP3上。 Sany
31、al等应用单克隆抗体中和逃逸突变株，确定口蹄疫病毒Asia I Ind 63/72株病毒表面至少有4个独立的胰酶敏感中和抗原位点，第1位点由4个不同的抗原表位组成，另外还发现有构象依赖性中和抗原位点的存在。,*抗原变异：口蹄疫病毒在复制过程中，可以导致主要表面抗原的变异，而且在地方性流行时，病毒主要表面抗原的变异是最重要因素之一。口蹄疫病毒核酸变异的频率相当高，流行前期的毒株与流行后期甚至中期的毒株可能就有差别。实际上口蹄疫病毒的血清型就是一个连续的抗原变异谱。现已证实，口蹄疫病毒抗原表位的氨基酸差异是造成抗原性改变的原因。Reddy等测定了口蹄疫病毒Asia I Ind 63/72亚型编码4
32、种结构蛋白核苷酸序列，比较了Asia I 印度毒株与Asia I以色列毒株的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列，发现核苷酸变异程度(14%)明显大于氨基酸变异(10%)的程度。核苷酸变异主要在三联体密码子的第3位碱基上，而且基本上都是同义突变；氨基酸的变异最明显的是发生在构成抗原位点1的G-H环内，其中结构蛋白VP1氨基酸变异程度最高，其次是VP2，VP3、VP4变异程度最小。Martenez等对许多流行毒株进行分析，认为VP1 138一140和148一150两段氨基酸变化对抗原有渐变性影响，而某些位置上氨基酸的变异造成抗原性的突变，完全改变毒株的生物学特性。已发现感染期间的抗原变异是持续性感染病
33、毒逃逸宿主反应的机制之一。,Parry等报道，O型口蹄疫病毒VP1第148位氨基酸由亮氨酸转变为丝氨酸(LS)，其合成肽(VP1 141一l60)免疫的豚鼠能同时抵抗A型、O型口蹄疫病毒的攻击，C1型口蹄疫病毒VP1第139位氨基酸由丝氨酸转为异亮氨酸，使病毒转变为C3型特异性。 Carillo等，Rieder等将口蹄疫病毒A24 Cruzeiro、Ol Casoros的克隆株与亚中和剂量的抗病毒多克隆血清在继代单层牛胎肾细胞上传至一定代数后，发现该克隆株的结构蛋白VP1电泳迁移率改变，对小鼠的致病性降低。口蹄疫病毒毒株在体外抗体压力下，获得了与弱毒突变株相同的表型标志。此外，研究发现，如无抗
34、病毒多克隆血清的压力选择，变异将不发生，即使经过29代增殖，编码VP1的RNA序列仍保持遗传稳定性。Holguin等的研究表明，在缺乏免疫压力的情况下，口蹄疫病毒和其它病毒的抗原变异仍发生，不论免疫压力是否存在，氨基酸代换都会在VP1的2个高变区发生。故宿主的抗体压力选择在口蹄疫病毒的高度变异中的作用仍有待于进一步研究。,遗传系谱树 许多研究者试图应用RT-PCR与核酸序列测定技术进行口蹄疫病毒的VP1基因核酸序列的同源性比较。通过同源性比较分析某一地区流行毒株与疫苗毒株的亲缘关系，建立该地区具有代表性毒株的系统发生树，从树状图中可以直观地了解该地区口蹄疫流行的毒株谱系、分子流行病学及病毒演化
35、的规律。 Juan等从24株病毒VP1的核酸序列推导出O型口蹄疫病毒的遗传系谱树，树中包括4个谱系，其中3个与地理位置有关。从树状图中可以看出，大范围的疫苗接种可能改变了口蹄疫病毒的进化方式。Samuel等应用VP1基因核酸序列分析方法对1983一1995年沙特阿拉伯分离的68株口蹄疫病毒O型毒株进行了分子水平检测。还比较了14株中东流行毒株(1987一1991)、4株疫苗毒株，其中3株是中东疫苗毒株，1株是欧洲分离株。结果在每一亚谱系中都能看出疫苗毒株与流行毒株的亲缘关系。这为疫苗毒株可能引起疫病流行提供了又一证据。 最近，Pattnaik等应用VP1基因3端165个核苷酸序列分析方法，从1
36、987一1995年印度分离的25个流行毒株与印度当前使用的疫苗毒株R2/72推导出O型口蹄疫病毒系统树。该研究表明在印度散播并引起口蹄疫暴发的O型毒株遗传变异，但在VP1多肽的主要免疫位点是相关的，表明该国每一个地区有一种以上遗传性不同的毒株群存在。,追踪口蹄疫暴发的疫源 选择口蹄疫疫苗毒株，不能仅仅由1次口蹄疫暴发而定，而是要进行大范围流行病学和免疫学调查。要对大量的田间分离毒株进行研究，选择抗原谱广、免疫原性好的毒株用于制造疫苗。 尽管人们认为Asia I只在中东流行，但最近的研究表明，该型毒株还与O型口蹄疫病毒混合感染。woodbury等分析在沙特阿拉伯分离的口蹄疫病毒O型空斑纯化物，证
37、明该次口蹄疫的暴发是源于混合感染。用ELISA检测发现1985一1991年收集的31份样品中有16份含Asia I病毒，对Asia I型病毒株核酸序列分析表明，它们与俄罗斯兔化弱毒疫苗株Asia I/Tadzhi/Risran/84和土耳其株Asia I/TUR/15/73有很近的亲缘关系，故认为当地口蹄疫的流行可能是从国外传入的毒株混合感染引起的。 研究发现，口蹄疫病毒在传代过程中具有高度易变的特性，同一分离株在不同的实验室经若干年传代，其后代在系谱树中属不同的亚谱系，故极难分离到某一性状长期保持不变的口蹄疫病毒。因此，口蹄疫病毒的研究还任重道远。我们相信，通过口蹄疫病毒分子生物学的研究，将
38、会有较大的进展和突破。,消灭口蹄疫面临的艰巨任务,疫源难以根除 FMDV感染的动物谱太广，且长期带毒排毒，病毒在体内存活数月、数年或终生，并在群体中能世代传递。大量的隐性感染动物和广泛的疫源地，大量的带毒的、被保护的野生动物形成的自然疫源地等等。 传播媒介难以切断。 FMDV的复杂性 FMDV有O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型和70多个亚型。各血清型具有不同的抗原性，且不能交叉免疫，在毒力和抗原性方面特别容易发生变异。 检测技术 近年来，国外已应用ELISA、PCR技术检测FMDV。但现有的方法都不能满足快速检测及时调运的要求。也不能快速准确地进行疫源追踪、抗体
39、检测以及疫情预测预报。因此，需要研究建立一种快速、准确、灵敏的新的诊断、监测方法。,基本要求基本要求是“早、快、严、小”四个字。意指尽早发现疫情，快速采取措施，严格封锁疫点，将损失降低到最小程度。这四点基本要求应贯穿整个FMD预防、控制和消灭过程中。 基本措施* 病畜及感染动物的扑杀 扑杀病畜及感染动物的目的是消除传染源。病畜是最重要的传染源，其次是非持续性感染的隐性带毒动物，最后是牛羊等持续性感染的带毒动物。因此根据防疫的实际情况，扑杀动物的次序依次是:病畜、病畜的同群畜、疫区所有易感动物、其他地区的持续感染动物及其同群畜。,口蹄疫的扑灭策略基本上可以分为非疫国(FMD free count
40、ry)爆发疫情时的紧急扑灭策略与口蹄疫常在国的长期扑灭策略两种。 非疫国爆发口蹄疫疫情：紧急扑灭策略又可分为包括扑杀清场、扑杀清场加环带免疫及全面免疫三种策略，各国可依爆发疫情初期发病场数的多寡、疫情调查与通报系统的效率、动物种群密度分布、管制动物移动的能力、有无疫苗或抗原银行(Antigen bank)的储备、政府财政能力的强弱等因素来评估选择最合适的扑灭策略。 口蹄疫常在国：采用全面免疫或划分疫区的策略。全面免疫策略一般先在全国实行所有偶蹄类动物的强制免疫，在临床病例消失后按世界动物卫生组织的规范，逐步变为使用疫苗的非疫国及不使用疫苗的非疫国。划分疫区的策略即在国内进行疫区与非疫区的划分，
41、疫区采行全面免疫、非疫区则不使用疫苗，再循序渐进将疫区变为非疫区来执行全国的扑灭计划。非疫区的划定主要取决于地理环境、行政区域与动物族群的分布等因素。,* 免疫接种。疫苗接种是防治战略的一个重要组成部分，通过提高国家整体畜群的免疫水平，可降低FMD暴发的影响和流行范围。免疫接种的目的是保护易感动物。根据现行FMD疫苗的免疫效力，注射密度达到85%就能起到阻止流行的作用。疫苗接种分为常年计划免疫和疫点周围的环状免疫。实施免疫接种应根据疫情、疫苗种类和防治政策选择免疫方式、接种剂量和次数。但单独的疫苗接种不能最终消灭FMD。 * 控制动物、动物产品及其他染毒物移动。此项措施的目的是切断传播途径。疫
42、区带毒动物及其产品向非疫区流动是FMD传播的最主要途径，是各种防治政策中不可缺少的措施。 * 强制提高动物卫生措施，彻底清除疫源。动物卫生措施主要是染毒区的清洁消毒，此外，还包括关闭限制区内市场，关闭屠宰厂或改善其卫生条件，强制提高奶罐、乳品厂、肉食厂和屠宰厂的消毒水平，以利于来自限制区的动物产品的卫生控制。为预防畜群与毗邻的潜在感染的野生动物或家畜接触，要做到有效隔离。,* 流行病学调查与监测。流行病学调查与流行病学监测是任何疫情状态下都应采取的基本措施。流行病学调查的主要内容是追溯疫源和追踪疫区外流的可疑传染源。前者的目的是查清和切断疫源并吸取经验教训，后者的目的是消除可疑的新疫源，防止疫
43、情扩散。流行病学监测的内容是疫情和免疫水平的监测，包括临床观察、病原学和血清学检验。目的是为疫情预警预报提供科学依据。 * 预警预报风险分析。通过流行病学调查，建立FMD流行病学监测系统，定期发布国内外疫情发生发展的动态，绘制全球疫情动态分布图，建立起反映动物疫病发生发展与风因子相关的疫情预警或预报数学模型，以减小从有FMD地区或国家引入病毒的可能性。根据疫病危险因子与疫病发生间的定量关系，区别不同区域，对疫病发生的概率和可能造成的危害损失进行评估，并根据评估结果提出降低风险至最低程度的预防性对策。,检疫规程 （中华人民共和国国家标准-口蹄疫检疫规程）,补体结合试验 反向间接血凝试验 细胞中和
44、试验 定量测定动物血清中的FMDV抗体 VIA抗原琼脂扩散试验 利用FMDV的病毒感染相关（virus infection associated，VIA）抗原检测动物血清中的相应（群特异性）抗体，判断被检动物是否感染过口蹄疫病毒。 琼脂扩散沉淀试验 可分型鉴别动物血清中的FMDV抗体 查毒试验（probang test，食道-咽部病毒探查试验）是以牛、羊食道-咽部分泌物（O-P液）为样品，检测康复动物（活畜）是否带毒。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 是检测动物组织、如屠宰后采集的淋巴结、脊髓和肌肉等，以及O-P液中的口蹄疫病毒（核酸）。,用于检测和分型鉴定发病动物的水泡皮和水泡液等病料
45、中的口蹄疫病毒抗原,口蹄疫自然感染动物与免疫动物鉴别诊断FMDV 抗原结构十分复杂，存在广泛的抗原变异，即使是免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒。在免疫和非免疫条件下病毒均可适应机体而长期存在。发达国家往往通过捕杀感染及同居动物和可疑畜群来控制和消灭本病， 而大多数国家，主要通过注射疫苗来控制该病流行 。在采取捕杀政策的国家，如何检测隐性感染动物， 在注苗国家如何区分自然感染动物和免疫动物一直是控制和消灭FMD 的重要论题。因而建立一种区分免疫动物和感染动物，检测隐性感染动物的诊断方法就成为FMD 防制技术的关键。也是国际兽医局判定一个国家或地区有无口蹄疫的依据之一。许多资料认
46、为 3ABC 作为感染的标志可信度较大，检测3ABC 抗体是确诊感染的重要指标。3ABC-EL ISA 是普查感染动物血清的最好方法。但此种方法受到动物年龄和免疫史等多种因素的影响。,口蹄疫的研究热点,病毒持续感染FMDV 持续感染的一个重要理论就是：FMDV 抗原变异学说，他们认为病毒的抗原变异导致宿主免疫系统不能清除病毒，即病毒抗原变异逃避了宿主免疫应答。目前的研究发现：免疫应答的压力迫使病毒抗原发生变异不是FMDV 形成持续感染的关键因素。研究发现不同毒株形成持续感染的能力存在差异，有些毒株建立持续感染的效率极高，但有些毒株效率很低或根本不能形成持续感染。研究病毒在宿主体内的动态水平和生物特性，进一步明确在分子水平持续状态病毒的根本特性，以便于在口蹄疫的流行病学研究中制定更有效的预防措施。,病毒编码蛋白的结构与功能 新型疫苗的研究 诊断技术,
