1、骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究口腔颌面外科杂志 2006 年 3 月第 16 卷第 1 期JournofOralandMaxiUofacialSurgeryVo1.16No.1March,2006?23?骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究孙树洋,张风河,郝轶,周小青(山东大学 I=1 腔医学院,山东济南 250012)【摘要】目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs) 体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性.方法:取新生 Wistar 大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出
2、SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白 2(AdBMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定.结果:转染后细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性增强(P0.01)且组织化学染色呈阳性.骨钙素及 I 型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d 后见钙结节形成.结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞.【关键词】骨骼肌卫星细胞;成骨样细胞;转染;种子细胞【中图分类号】R318;Q813.11【文献标识码】A【 文章编号】1005-4979(2006)oloo2304StudyontheDifferent
3、iationofSkeletalMuscleSatelliteCellsTransfectedbyAd-BMP2GeneintoOsteoblast-likeCellsSUNShuyang,ZHANGFeng-he,HA0Yi,ZHOUXiaoqing(CollegeofStomatology,ShandongUniversity,Jinan250012,ShandongProvince,China)【Abstract】Objective:Toassesstheabilityofinducingskeletalmusclesatellitecells(SMSCs)intoosteoblastl
4、ikeceHs,andtoapproachthepossibilityoftreatingskeletalmusclesatellitecellsasanewseedcellforbonetissueengineering.Method:TheskeletalmusclesofnewbornWistarratswereacquiredtoseparateskeletalmusclessatelliteceHswithenzymedigestion.Cellsareculturedandsubcuhuredinvitro.AfterbeingtransfectedbyAd-BMP2gene,ce
5、llswereexaminedbyosteoblasticmarkerSactivitytest,cytochemicalstainingandmineralizedcapabilityinvitro.Results:AftertheceHsweretransfected,therewasasignificantincreaseinALPactivity(P0.o1),theceHswerefaintpositivewitllimmunocytochemicalstainofosteocalcinandtypeIcollagen.CalciumnoduleswereseenafterceHsw
6、ereculturedfor21days.Conclusion:SMSCshavethecapacibilitytobedifferentiatedintoosteoblastandtoberegardedastheseedceHsforbonetissureengineering.Keywordsskeletalmusclesatellitecells;osteoblastlikecells;ansfection;seedcells骨缺损的修复一直是临床上所面临的难题.近年来骨组织工程的发展为骨缺损的修复带来了亮点,但至今尚未找到理想的运送成骨诱导因子的种子细胞.自 Mauro 首次发现骨骼
7、肌卫星细胞后,人们对肌卫星细胞产生了极大的兴趣11.近年来,学者们围绕骨骼肌卫星细胞开展了大量的研究工作.但还未见有把成骨基因转移人骨骼肌卫星细胞,使之分化为成骨样细胞的报道.收稿 Et 期:20050824作者简介:孙树洋(1979 一),男,山东人,硕士研究生.E-mail:sunshuyang123163.conl通讯作者:张风河(1965?),男 ,副教授.Email:本实验尝试骨骼肌卫星细胞的体外培养,并进行成骨基因转染,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程新的种子细胞的可能性.1 材料与方法1.1 实验动物与材料Wistar 大鼠(购自山东大学动物中心);胎牛血清(杭州四季青公司);D
8、MEM/F12 粉剂(Hyclone 公司,美国);I 型胶原酶 ,无菌多聚赖氨酸 (Sigma公司,美国);胰蛋白酶(Amersico 公司,美国);结蛋白(desmin)单抗,骨钙素(0C)一抗,BMP.2 一抗(武汉博士德公司);腺病毒介导的人骨形成蛋白 2?24?口腔颌面外科杂志 2006 年 3 月第 16 卷第 1 期JournalofOralandMaxillofacialSurgeryVo1.16No.1March,2006(Ad.BMP,)基因(山东大学齐鲁医院魏奉才教授提供).1.2 实验方法1-2.1 细胞培养根据 Doffman 等21 的两步消化法,取新生 Wista
9、r 大鼠(3d 以内,雌雄不限),麻醉后,无菌条件下切取其四肢肌肉,在外科显微镜下剔除肌肉表面筋膜及内部血管,用含抗生素(青霉素1000u/mL,链霉素 1000u/mL)的 D.Hanks 液冲洗3 次后,移人培养皿中.再将标本剪为 O.5mm 左右的小块,移人离心管中,加入培养液,静止 3min,去掉上层漂浮组织,0.1%I 型胶原酶消化 30min,加DMEM/F12 培养液离心(1000r/min)3 次,弃上清.0.25%胰蛋白酶消化 lh.加含 20%胎牛血清的培养液终止消化,依次滤过 100 目,200 目,400 目不锈钢网.滤液 1000r/rain 离心 5min,用含 2
10、0%胎牛血清的培养液重新悬浮细胞,采用差速贴壁法纯化细胞,细胞记数后接种经多聚赖氨酸处理的玻璃培养瓶或未做处理的塑料培养瓶中.3d 后换液,以后每天换液 1 次,倒置显微镜下观察细胞的形态及生长情况.当细胞接近 80%汇合后,传代培养.对所培养的细胞行结蛋白(desmin)的免疫细胞化学鉴定.1.2.2 基因转染取传至第 2 代生长良好的骨骼肌卫星细胞,用 O.25%胰蛋白酶消化后,按 lxl0s 个/孔的密度重新接种于 6 孔板.在 37,5%CO,的恒温培养箱中培养 1d.用吸管吸尽培养液,D.HankS液洗 2 次.6 孔板中加入 AdBMP100IxL(MOI=100.PBS 稀释成
11、lmE)转染细胞 .置 37,5%CO 的恒温培养箱中培养 1h 后,补足培养液继续培养.1-2I3 碱性磷酸酶 (ALP)检测 ALP 的检测按以下步骤进行1.2.3.1ALP 细胞化学染色取转染 5d 后的骨骼肌卫星细胞爬片,用改良钙钴法行碱性磷酸酶(ALP)染色 .1.2.3.2ALP 活性测定取转染后及未转染的细胞,设立转染组(实验组) 及未转染组(对照组). 于培养 3,5,7,9d 时收集细胞,riffs 缓冲液冲洗,超声细胞仪裂解细胞,按 ALP 检测试剂盒的要求,用分光光度计测定 405am 波长下的吸光度,计算两组细胞的 ALP 活性.1-2.4 免疫细胞化学染色具体步骤如下
12、.1.2.4.1 检测项目取转染 5d 后的肌卫星细胞爬片行骨钙素(osteocalcin,OC)及 I 型胶原的免疫细胞化学染色.1.2.4.2 染色步骤当盖玻片上的细胞大约 5O%融合时.取出盖玻片,PBS 冲洗 ,室温自然风干,95%乙醇固定 30min,蒸馏水洗;1 份 30%H2O2 与 5O 份100%甲醇混和,室温下将玻片置于其中 30min(灭活内源性过氧化物酶),蒸馏水洗 3 次.滴加正常山羊血清封闭液,室温 20min,甩去多余液体,不洗.滴加适当稀释的 OC 及 I 型胶原一抗,37,1h,也可 4过夜后,PBS 洗 2minx3 次.滴加二抗,37,20min,PBS
13、洗 2minx3 次.滴加试剂 SABC,37,20min,PBS 洗 5minx4 次.DAB 显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,显微镜观察,胞浆内出现棕黄色沉淀为阳性,不着色者为阴性.1.2.5 矿化结节的茜素红染色取培养 21d 的细胞爬片,PBS 冲洗 ,用 95%乙醇固定 10min,蒸馏水冲洗,以 2%茜素红染色约 35min,蒸馏水冲洗,干燥,封片,矿化部分呈红色.2 结果2.1 骨骼肌卫星细胞的形态及鉴定倒置显微镜下,刚消化分离出的原代骨骼肌卫星细胞呈球形或椭圆形,折光性较强.培养 12h 后,细胞开始贴壁,此时仍为球形.72h 后细胞完全贴壁,伸展为梭形或纺锤形(图 1
14、).随着培养时间的延长.细胞数量的增加.相近细胞连接成网.在培养瓶中.当细胞局部密度高出 7O%.此区域相邻细胞很快融合为一长条的肌管结构(图 2).在培养过程中看到肌管有自主性收缩现象.传代后半小时细胞开始贴壁,12h 贴壁完全,细胞增殖速度加快明显.传至第 ll 代,细胞老化,表现为细胞边缘不规则,细胞突起明显增多.传至第 14 代.细胞老化.Desmin 免疫细胞化学呈阳性(图 3).2.2ALP 检测结果2-2.1ALP 细胞化学染色改良 Gomori 氏钙钴法显示转染后的细胞.可见胞浆内有黑色颗粒沉淀(图 4).2.2.2ALP 活性的定性测定各时间点 ALP 活性定性测定数值见表
15、1.细胞培养第 3,5,7,9 天.实验组和对照组的 ALP 活性均有显着性差异(PO.O1).2.3 免疫细胞化学染色转染 5d 后的肌卫星细胞爬片行骨钙素(OC)及 I 型胶原免疫细胞化学染色呈阳性(图 5).2.4 矿化结节的测定sludlIaBle,uH,g.II1(【l1illJllj,IIMJ l】1(JIIIl 【转 ll/jJi咆悱驯连缝蚺挥 21cI-r 钙 t 一 i 的形啦(61目 2l40)kigitr2,btlIhI.Ix411】一,目 3DeSmln20)3lmu|1.曲,m p1)sili1mfm1L“目 4#白勺ALP 自 Gomorl2O)Figure,4【v
16、tI)chnnlctIT_ih.l0sIlJrIlJinlnl|-lld,IS(Ix1AdBMP2 卫 gALP(_TahleIAIIncv.“ofMIhyAdBMP?tdI.,5#日勺 OO(A 目)IB 目)Ecx20】n5muIry“l-mlslE1wlIH?州 l1Lnf0t,IAIa,l(Ilh?|l1llixlh目 6 镕节 mcx4O1Figure6CalciumT1nduIPHIOrllllzl(x403 讨论骨骼_l_是一种 m】垃熟帆蚵维段 Lf 勺川【前体细胞常 f-l,1l_修基损帅肌纤维哺lf】化浊悱外分离忖骼 Jl;Ll】圳胆垃 D(,rl-i111 等对叭璺讣离情
17、养疗诖的进何盘献揣 j呲址眦施力差使川术羟址胛的玻璃瓶戒出性的料蚺捧瓶细咆能贴壁而亡.日哉 l 骑 rll 镟观.啦幢种粜挂钟玻螭埭本m【瓶底 r1.l雌进细胞帖壁的试剂 ffc_l 多糍氟砖鼠恺脞)进行处理:蜘拙刊-培非啦 t 培捧舭九处.也就能j 仆发眦.增 Jj_I消 Irl0 浩能进州 IJ,ji 坫拦 i1ctJf-)齄Ij 细心_一的,志 ii 目骼肌肌动盖门 cdl-?26?口腔颌面外科杂志 2006 年 3 月第 16 卷第 1 期JournofOralandMaxinofacialSurgeryVo1.16No.1March,2006ricactin)更是骨骼肌特有的标志物
18、【5j,故目前多通过desmin 及.sarcometricactin 来鉴定肌卫星细胞.成骨细胞的标志物.如碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OC) 及 I 型胶原 ,是识别及估价成骨细胞分化的生化指标.对成骨细胞标志物的测定,可以反映出细胞向成骨方向分化的程度.钙结节是成骨细胞形成矿化时的细胞外基质.是成骨细胞分化的最后阶段;故钙结节的形成是成骨细胞特性之一嗍.实验中 ,我们对 Ad.BMP2 基因转染后的骨骼肌卫星细胞行成骨细胞标志物的活性检测及免疫细胞化学染色,r 并进行细胞体外矿化能力的测定,发现 ALP 活性增强且 ALP,OC 及 I 型胶原的免疫细胞化学染色,均出现阳性结果;转染细
19、胞体外培养 3 周后,检测到了钙结节的形成.说明骨骼肌卫星细胞经成骨基因转染后,已具备了成骨细胞的生物学特性.目前骨组织工程种子细胞多集中在骨髓基质干细胞的研究上,实际上机体骨髓中所含的基质干细胞数量非常有限.短期内扩增无法达到成骨所需的细胞数量,长期扩增细胞易老化.干细胞可塑性减弱,难以向成骨方向转化.Blau 等【01 发现骨骼肌卫星细胞是哺乳动物体内唯一能大量分裂,增殖,分化的前体细胞.而我们又通过实验证实了骨骼肌卫星细胞具备干细胞的可塑性.在成骨诱导下能向成骨方向转化.故骨骼肌卫星细胞有望成为理想的骨组织工程种子细胞组织工程联合基因治疗是当前骨组织工程发展的趋势,把外源性基因转移人相应
20、的靶细胞.通过在靶细胞内扩增表达,使之稳定且长时间的表达目的基因.基因的成功转入需要基因表达载体,目前应用的载体主要分为两大类,即非病毒载体及病毒载体.后者较前者转移效率高,而且目的基因表达量大,时间长,腺病毒转移载体能高效率的表达具有完全功能的目的基因,是骨创修复和骨病治疗较理想的载体【l“. 为了后续的实验研究,本实验室成功构建了BMP 一 2 腺病毒表达载体 .通过腺病毒表达载体将BMP 一 2 基因转入体外培养的骨骼肌卫星细胞 .使之成功转化为成骨样细胞,为我们后续的实验奠定了基础.参考文献:1】BaroffioA,Bochaton-PiallatMLGabbianiG,eta1.He
21、terogeneityintheprogenyofsinglehumanmusclesatelliteceHsj.Differentiation,1995,59(4):259-268.2】DoffmanJ,DuongM,ZibaitisA,eta1.Myocardialtissueengineeringwautol-OU8myobltimplantationJ】.JThoracCardiovascSurg,1998,l16(5):744-751.3】夏家红 ,谢艾妮,许磊,等.大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究J.中华实验外科杂志,2005,22(2):2142l5.4BaroffioA,B
22、ochatonpiallatMLGabbianiG,eta1.HeterogeneityintheprogenyofsinglehumanmusclesatellitecellsJ.Differentiation,1995,59(4):259268.5】杨志明 ,岑石强,解慧琪,等.原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性J】.中国修复重建外科杂志,2001,15(5):562-568.6RodanGA,NodaM.GeneexpressioninosteoblasticcellsJ.CritRevEukaryotGeneExp51991,1(2):8598.7】WattsNB.Clinical
23、utilityofbiochemicalmarkersofboneremodelingJ.ClinChem,1999,45(8):13591368.8】LisignoliG,ZiniN,RemiddiG,eta1.Basicfibroblastgrowthfactorenhancesinvitromineralizationofratbonemarrowstromalcellsgrownonnon-wovenhyaluronicacidbasedpolymerscaffoldJ.Biomaterials,2001,22(15):2095-2105.9】MuschlerGF,BoehmC,Eas
24、leyK.Aspirationtoobtainosteoblastprogenitorcellsfromhumanbonemarrow:theinfluenceofaspirationvolumeJ】.JBoneJointSurgAm,1997,79(11):1699.1709.1OBlauHM,WebsterC.IsolationandcharacterizationofhumanmusclecellsJ】.ProcNatlAcadSciUSA,1981,780):5623-5627.11】KaiharaS,BessboK,OkuboY,eta1.Simpleandeffectiveosteoinductivegenetherapybylocalinjectionofabonemorphogeneticprotein-2-expressingrecombinantadenovi-ralvectorandFK506mixtureinratsJ.GeneTher,2004,
