1、高效液相色谱法检测人血浆单硝酸异山梨酯的研究余甜女,吴姜媛(丽水学院医学院,浙江丽水 323000)山V01.272O09No.18摘要:目的建立人血浆单硝酸异山梨酯检测的高效液相色谱方法 .方法血浆经乙酸乙酯一正己烷萃取,以 rCC18 为色谱柱;流动相为乙腈水(含 0.l%三氟乙酸),流速为 0.8ml/min;检测波长为 240nm(O-5m),230rim(57mia).测定 l8 名健康志愿者单剂量口服 40mg 单硝酸异山梨酯滴丸后的血药浓度经时过程 .由DAS2.0 程序计算药动学参数.结果单硝酸异山梨酯浓度在 l0800g,L 范围内线性关系良好; 定量下限为 10;高,中,低
2、 3 个浓度的相对回收率分别为(100.332.29)%,(101.052.56)%和 (105.362.81)%;日内 RSD 分别为 2_30%,1.30%和 1.60%,日间 ILSD 分别为 4.56%,4.96%和4.01%.结论本方法简便,快速,准确,可靠,适用于人血浆单硝酸异山梨酯浓度的测定及其药代动力学的研究.关键词:高效液相色谱法;单硝酸异山梨酯;人血浆;药代动力学中图分类号:G424.31 文献标识码:A 文章编号:1671 1246【2009)18 0104-02单硝酸异山梨酯(IsosorbideMononitrate)为二硝酸异山梨酯的主要代谢物,其主要药理作用是释放
3、一氧化氮,松弛血管平滑肌,降低心脏的前负荷和后负荷,使心肌耗氧量减少,供氧量增多,心绞痛得以缓解,是新一代血管扩张药,主要口服用于心绞痛的预防和心肌梗死后心衰的长期治疗.本研究参考有关文献,建立了以高效液相色谱法测定人血浆单硝酸异山梨酯的方法,其具有操作简便,测定速度快,试剂便宜等优点,便于推广使用.1 材料与方法1.1 喃品,试剂甲醇和乙腈(色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心);三氟乙酸(IFA,Sigma,064K3647);乙酸乙酯,正己烷,无水碳酸钠,磷酸(分析纯,天津市化学试剂三厂);实验用水均为重蒸水(本实验室自制). 单硝酸异山梨酯对照品(中国药品生物制品检定所,100694-
4、200401);对乙酰氨基酚标准对照品 (Sigma,064K0096);单硝酸异山梨酯滴丸(北京琥珀光华医药科技开发有限公司,0611201).1.2 仪器高效液相色谱仪为 Agent1100 系列,包括 G1322A 在线脱气机,G1311A 四元泵,G1313A 自动进样器,G1316A 温控箱,G1315B 二极管阵列检测器,Agilent 化学工作站(RevA.10.02).电子分析天平aB2o4 一 A,梅特勒一托利多(上海) 仪器公司】; 涡旋混合器(rZQ 一 2,江苏泰县医疗器械厂); 氮吹仪(D10 型,杭州蓝焰科技有限公司);重蒸水仪(1810 一 B 型,江苏金坛市科析
5、仪器有限公司).1.3 色谱条件色谱柱:rCC18(4.6x150lnln,5pan,Agilent,USA);保护柱 :TC-C18(4.6x12.5Inln,5m,Agihnt,USA);流动相:乙腈-0.1%TFA 一水=25:20:55(v,v,);流速:0.8ml/min;柱温:30; 检测波长:240nm(05win),230nm(57m).一1041.4 血采样品的处理方法准确吸取待测血浆样品 1.5ml 于 10Inl 具塞试管中,加入5.0g/ml 的对乙酰氨基酚标准对照品(内标)50, 混匀后加入 10%的碳酸钠溶液 500.再加入乙酸乙酯 4.0ml,正己烷1.0ml,进
6、行混匀 2min.转移上层有机相于另一刻度离心管中,在氮吹仪中吹干.用 200 流动相复溶,取复溶液于 0.5lIll 的EP 管中 ,经 12000rpm 离心 5min 后,取上清液于自动进样器的样品瓶中,设定加进样检测.2 结果2.1 色谱行为空白血浆,单硝酸异山梨酯血浆标准以及健康受试者血浆样品,经 HPLC 分析测定得到的色谱见图 1.内标的保留时间为3.3min,单硝酸异山梨酯的保留时间为 5.6min.0246t(mln)A1202t)46C注:A:空白血浆,B:血浆标准+内标,c:样品;l 为对乙酰氨基酚,2 为单硝酸异山梨酯图 1 单硝酸异山梨荫的高效液相色谱2.2采标准曲线
7、和定量下限2.2.1 血浆标准曲线取 8 只 10Il 具塞试管,依次加入不同浓度不同体积的单硝酸异山梨酯标准工作溶液,再加入空白血浆 1.5ll,配成浓度相当于 10,25,50,100,200,400,600,800tw,/L 的血浆样品,再按 1.4 项处理后,测定单硝酸异山梨酯的峰面积 A;,内标峰面积 A.,以 A/A.为纵坐标,以所对应各点浓度(c)为横坐标绘制标准曲线.经最小二乘法线性回归,得单硝酸异山梨酯的标准曲线回归方程为 C=543.7681Al/AO.5393(r=0.9999).2.2.2 定量下限取血浆标准曲线的最小浓度值 l0g,L 为定量下限.2.3 精密度准确配
8、制浓度为 25,200,600g/L 的血浆标准溶液(每种浓度 5 份),再按 1.4 项处理后,于同一日内测定 5 次和连续 5d测定,计算其日内,日间的精密度.结果见表 1.表 1 精密度试验结果()2.4 相对回收率准确配制浓度为 25,200,600g,L 的血浆标准溶液(每种浓度 5 份),再按 1.4 项处理后进样检测,计算检测量.以检测量与加入量的比值计算其回收率.结果见表 2.表 2 相对回收率结果(二)2.5 样品稳定性2.5.1 冻融条件下血浆样品稳定性配制低,中,高 3 种浓度的单硝酸异山梨酯血浆标准溶液,每种浓度 10ml;放入一 65冰箱中,2h 后解冻,各取 1.5
9、ll 血浆样品进行检测.剩余的血浆样品再次放人一 65冰箱中,2h 后解冻,各取 1.5IIll 血浆样品进行检测.3 种浓度的 RSD 分别为 3.62%,5.30%,1.53%,结果显示冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响.2.5.2 室温放置和冰冻保存血浆样品稳定性配制低,中,高 3种浓度的单硝酸异山梨酯标准血浆样品溶液,每种浓度 5 份,其中 3 份在室温下放置 0,6,12 小时后再经血浆样品处理方法处理后进样检测,并记录结果.另外 2 份分别放人一 65冰箱中冰冻保存 2 周和 4 周后,再经血浆样品处理方法处理后进样检测,并记录结果.3 种浓度的 RSD 分别为 3.71%
10、,6.08%,3.35%,结果说明血浆样品在室温放置和冰冻保存的条件下均有很好的稳定性.2.6 应用l8 名健康志愿者单剂量口服 40nag 单硝酸异山梨酯滴丸(北京琥珀光华医药科技开发有限公司,批号 0611201)后,血浆单硝酸异山梨酯的药一时曲线见图 2,主要药代动力学参数见表3.O4$12l6202832J6图 218 名健康志愿者单剂量口服 4omg 单硝酸异山梨醋滴丸后的血浆药一时曲线表 318 名健康志愿者单剂量口服 4omg 单硝酸异山梨醋滴丸的主要药代动力学参数(;)ParameterTestedC 越 l(11)tm(h)AUGo-(p,gh/L)AUQ)(P,gh/L)4
11、53.1867.440.60o.136.441.283O13.7O576.283155.97582.843 讨论单硝酸异山梨酯对紫外的吸收比较弱,集中在紫外末端.因为该物质比较容易气化,所以关于对其血浆浓度的检测,主要采用气相色谱一电子捕获监测器分析(GCECD)的方法,对此文献 1 报道较多.近年来采用高效液相色谱检测的方法也在陆续报道】.本研究根据已有的报道,建立了 HPLCUv 检测血浆单硝酸异山梨酯的方法,采用加大进样量和波长梯度的检测方法,获得了较好的色谱峰,并避免了血浆内源性物质的干扰.此方法专属性高,分离完全,成本较低廉,符合生物等效性指导原则的要求.本研究所用的色谱柱为 Agi
12、lentTCC18 色谱柱,该色谱柱使用超纯硅胶基质,具有高比表面积,12%碳载量和惰性表面,特别适合用于对酸性,碱性和中性混合物的分离.在此色谱柱上,大部分成分能够有较好的保留,并且得到对称的色谱峰.与 ZORBAXEclipseXDB 一(318 色谱柱相比嘲,单硝酸异山梨酯和内标的保留时间均延迟.因此,该方法流动相中乙腈的比例较高,系统的压力较低.本研究显示,健康志愿者单剂量口服 40mg 单硝酸异山梨酯滴丸后,在 0.6h 左右能够达到 450g,L 左右的峰浓度 ,半衰期在 6.4h 左右;峰浓度和半衰期与相关文献 M 报道接近.参考文献:【1】何林,余继英,吴正中,等.反相高效液相
13、色谱法测定血浆中的单硝酸异山梨酯忉.色谱,2005,23(5):528 530.2】胡玉钦 ,薛洪源,侯艳宁,等.复方单硝酸异山梨酯缓释片的人体药动学和生物等效性研究叨.中国药学杂志,2004,39(2):931-934.【31 赵建波,张丽慧,叶环,等.单硝酸异山梨酯片荆在健康体的生物利用度们.浙江预防医学,2007,19(11):1315.【4】张正行,杭太俊,林梅,等.单硝酸异山梨酯缓释片生物利用度研究册.上海医药,2005,26(4):179182.5HUANGXia,CHENJun,RONGZheng-xing,eta1.Phannaeokinetiesofdomesticandimportedisosorbidemononitratesustained-releasecapsulefollowingasingleandmultipledoseinhealthyvolunteers 叨.中国新药与临床杂志,2002,21(8):449-453.A-.105.
