1、非小细胞肺癌（NSCLC）癌组织中 PTEN国际医药卫生导报 2.o 兰.蔓童塑!兰旦型!.垒薹:jI 硼 m_M_m_一一非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织中 PTENmRNA 表达的研究周国仁申维玺宣爱国刘玉梅江苏省肿瘤医院江苏南京 210009z 深圳市第一人民医院广东深圳 518020.广州医学院广东广州 510000摘要目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织中 PTENmRNA 的表达及临床病理意义.方法压用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)分别扩增 45 例非小细胞肺癌和 15 例癌旁组织中 PTEN 基因外显子 1-8 和 59,并结合临床病理资料进行分析.结果在 45 例非小细
2、胞肺癌组织中,PTENmRNA 的表达缺失率在外显子卜 8 和 59 分别为 48.9%(22/45),33.3%(15/45),而正常癌旁组织中全部呈阳性表达.二者在两组中表达缺失率的差别显着(PO.O5). 结论非小细胞肺癌组织中存在较高比例的 PTENmRNA 表达缺失,表明 PTEN 基因转录水平异常在非小细胞肺癌的发生发展中起重要作用.关键词 10q 丢失的与张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)肿瘤非小细胞肺癌(NSCLC)信使核糖核酸TheStudyontheExptessionofPTENmRNAinPathoIogicaITissueSectionsofNSCLCZHOUGuo
3、ren1SHENWeixiXUANAiguo.LIUYumeiJiangshuCancerHospital,Nanjing,2100092TheNo.1PeoplesHospitalofShenzhen,Shenzhen,518020.GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,510000AbstractObjectiveToevaluatetheexpressionofPTNEinpathologicaltissuesectionsofNSCLCaswellastheclinicalsignificance.MethodsThePTENmRNAinexon18and
4、exon5-9wereamplifiedbyreversetranscriptionPCRin45casesofNSCLCand15casesofadiacentpathologicaltissue.Theresultsobtainedwereanalyzedwithclinicaldata.Resultsinpathologicaltissueof45casesofNSCLC,thelossofexpressionsofPTENmRNAinexon 卜 8andoxen5-9wererespectively48.9%(22/45),33.3%(15/45).ExpressionofPTENm
5、RNAwaspositiveinallofthenormaladjacentpathologicaltissues.ThedifferenceofthelostrateofexpressionofPTENmRNAwassignificantamongthetwogroups(尸0.05).ConclusionTherewasahigherincidenceofnegativeexpressionofPTENmRNAinpathologicaltissueofNSCLC,whichindicatesthatPTENgeneinactivationmayplayanimportantroleint
6、hegenesisanddevelopmentofsomeNSCLC.KeywordsPtenNeoplasmNonsmallcelllungcancerMRNA中图分类号:R730.21;R446.61 文献标识码:A 文章编号:10071245(2007)150017-06影响肺癌预后的因素很多,传统的因素如性别,年龄,淋巴结转移,TNM 分期等临床因素,从现代分子生物学的角度来说,癌基因,抑癌基因是肿瘤形成的本质.PTEN/MMAC1/TEP1 基因是最近发现并命名的一种抑癌基因,该基因定位于染色体 lOq23,在多l7国际医药卫生导报 2007 年第 13 卷第 15 期(半月刊)种进
7、展期肿瘤中均有突变,如恶性胶质细胞瘤,前列腺癌等,其编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,PTEN 的氨基端与细胞骨架蛋白 tensin 同源能被转化生长因子 B 下调,并在上皮细胞中高度表达hi.本研究应用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)探讨 3tl,J-,细胞肺癌 (NSCLC)癌组织中 PTENmRNA 的表达及临床病理意义.1 材料和方法1.1 研究对象及分组1.1.1 对象 2003 年 1 月2006 年 12 月于广州医学院临床肿瘤研究中心手术切除的 NSCLC 患者新鲜肺组织标本 45 份.者中男 28 例,女 17 例,中位年龄 57 岁.各病例的病历详细记录年龄,性别,TN
8、M 分期,淋巴结转移情况.1.1.2 分组根据 WHO(1981 年) 肺癌的分类方法进行组织学分类,其中腺癌 20 例,鳞癌 25例.依据肿瘤分级标准(组织结构,异型性,核分裂象等)分为中高分化组,低分化组.肿瘤分期按国际抗癌联盟(UICC,1997 年)的 TNM 分期,I 期和 II 期划为临床早期 28 例,III 期为临床晚期 17 例.1.1.3 对照 15 例 NSCLC 癌旁肺组织 .1.2 检测方法:逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)1.2.1 试剂 Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司),RTPCR 试剂盒(Invitrogen 公司).1.2.2 主要实验仪器
9、 DY89 一 II 组织匀浆器(宁波新芝生物科技股份公司),生物分光光度计(ePPend0rf 公司).1.2.3 引物合成根据 Genebank 显示外显子18 和 5-9 片段基因 cDNA 序列,以及引物设计要求,两套引物及内参照分别为:18 外显子引物:E 游 5CGAAGCTTCCACCATGACAGCCATCATCAAA 一3下游 5一 TCTATACTGCAAATGCTATC 一 3扩增产物长度:933bp5-9 外显子引物:上游 5一 ATCAAACCCTTTTGTGAAGA 一 3下游 5一 TTGGATCCTCAGACTTTTGFAATTTG 一 3扩增产物长度:920b
10、pBaCti3:l8上游 5一 CTCAGACACCATGGGGAAAGGTGA 一 3下游 5ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA 一 3扩增产物长度:650bp以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.1.2.4 组织 RNA 提取1.2.4.1 取肺癌组织或者癌旁组织 50100mg,迅速置于匀浆器中,加入 iml 的 Trizol 试剂,将其匀浆.1.2.4.2 取匀浆液 0.5ml 于离心管中,于 1525放置 5 分钟.1.2.4.3 加 0.2ml 的氯仿于上述离心管中剧烈震荡 15 秒,在 1525放置 215 分钟.1.2.4.4 在 2C8,12000xg
11、离心 15 分钟.1.2.4.5 将上清液的 2/3 转移至另一离心管,加入等体积的异丙醇,颠倒几次混匀.1.2.4.6 放置于室温 510 分钟,12000xg,12 分钟离心,弃上清.1.2.4.7 加 1ml75%的乙醇于离心管,漂洗RNA 的沉淀物.7500Xg,5 分钟离心,弃上清.1.2.4.8 将离心管放置空气中干燥 510 分钟.加 DEPC 处理的无 RNaSe 的水,重悬 RNA 的沉淀物,溶解至 2030l.吸出 2ul 溶液,使用分光光度计计算 A260/A280 比值,计算 RNA 含量;另取 5ul 溶液,经1%琼脂糖凝胶电泳,鉴定 RNA 抽提质量;剩余 RNA溶
12、液保存于一 70.C 备用.1.2.5 常规 RTPCR 法扩增外显子卜 8 和 5-9片段1.2.5.1 使用随机引物进行逆转录反应体系如下:5xBuffer4ulDTT(0.1M)1IJlWater1ulRNaseOUTTM1ulThermoScriptMRT1ulRNA+随机引物 +dNTPS(12u1)I65,5min4I5550min85,5minI国际医药卫生导报 2007 年第 13 卷第 l5 期(半月刊 )加 1lRHaseH,37,2Omin反应结束将 cDNA 置一 20保存.1.2.5.2PCR 扩增目的片段反应体系:10XPCR 缓冲液 5150mMMgc121.51
13、10mMdNTPs1l上下游引物各 lOpmolTaq 酶 2UcDNA2l加双蒸水至总体积为 501PCR 反应条件是:94预变性 3min,然后 9445S,56oC45S,7290S,扩增 40 个循环,72延伸 1Omin.内参照 B 一 3Ctin 引物序列为fwd,5 CTCAGACACCATGGGGAAAGGTGA 一 3,rev,5ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA 一 3扩增产物的长度为 650bp,扩增 30 个循环.1.3 结果观察取 5IPCR 产物以 1%琼脂糖凝胶 (EB 染色)电泳,80V,1h,于紫外灯下观察并照相.1.4 统计学分析应用 2 检验及
14、四格表确切概率法,用 sPss12.0 统计软件进行统计学分析.2 实验结果2.1NSCLC 患者肿瘤组织和癌旁组织中PTENmRNA 表达缺失表 1NSCLC 患者肿瘤组织和癌旁组织中PTENmRNA 表达缺失注:NSCLC 患者的肿瘤组织中 PTENmRNA 缺失和癌旁组织有显着性差异,尸O.O5.2.2 不同病理类型 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失表 2 不同病理类型 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失注:不同病理类型 NSCLC 的患者的 PTENmRNA缺失没有显着性差异,尸0.05.2.3 不同病理分期 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失表 3 不
15、同病理分期 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失注:不同病理类分期 NsCLC 的患者的PTENmRNA 缺失有显着性差异,尸0.05.2.4 不同组织分化 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失表 4 不同组织分化 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失注:不同组织分化程度 NSCLC 的患者的PTENmRNA 缺失没有显着性差异,尸0.05.3 讨论PTEN 蛋白是世界上首次发现的一种蛋白酪氨酸磷酸化酯酶,是蛋白酪氨酸激酶(proteintyroSinekinases,PTKs)拮抗剂,目前大多数学者认为,其生理底物是 PiP3,是通过调控 PiP3 通路抑制了细胞增殖
16、,PTEN 的表达异常可引起细胞的异常增殖,导致肿瘤的发生发展.根据此机制,有助于揭示相关肿瘤的发病机制,为肿瘤的预防,诊断,治疗以及判断预后起指导作用.PTEN 基因外显子 5 为功能结构区,最常见的PTEN 突变发生于外显子 3,5,7 和 8,突变的PTEN 基因转录的 mRNA 以及蛋白的表达降低,甚至不表达,使 PIP3 不能去磷酸化,允许本应死亡的异常细胞无节制生长.PTEN 异常表达常见于胶质细胞瘤,前列腺癌,乳癌,内膜样癌等,PTEN与 tH,细胞肺癌的发生,发展是否相关,迄今尚无一致的认识.3.1NSCLC 患者肿瘤组织中 PTENmRNA 表达缺失非小细胞肺癌和癌旁肺组织中
17、 PTENmRNA 的表达所有标本均扩增出 Bactin 基因扩增带,证明RNA 提取及逆转录反应成功.PTENmRNA 的表达缺失率在外显子卜 8 和 59 分别为 48.9%(22/45),33.3%(15/45),15 例癌旁肺组织 PTENmRNA 全部呈阳性表达.目前,国内外有关 PTEN 与肺癌的研究报道不多,其结果也不完全一致.有研究显示 PTEN 主要19国际医药卫生导报 2007 年第 l3 卷第 l5 期(半月刊)通过基因的突变,缺失或甲基化而失活.SteckPA 等_3 对 30 例进展期肺癌患者的原发部位,转移部位及正常组织中的 PTEN 变异进行了研究,该研究发现,总
18、的等位基因的缺失率达 33.3%(7/21),在每例患者中,原发部位和转移部位等位基因的缺失是完全一致的,而且等位缺失发生在肿瘤转移之前,PTEN 基因的序列分析提示 30 例中有 4 例在外显子编码区上游第八个碱基发生 G-C 替换.SanoTl4 分析了 136 个肺癌细胞系(66 个小细胞癌,61 个非小细胞癌,4 个间皮瘤,5 个肺外小细胞癌),发现 53 个肺癌细胞系的 cDNA 的开放阅读框中存在点突变,而 PTEN/MMAC1 基因的表达可降低所有肿瘤细胞系的点突变.有报道,肺癌中 PTEN 的突变率仅为 6%8%, 而 PTENDNA 纯合性丢失在肺癌细胞系中占 8%40%I5
19、. 但也有一些结果相反的报道,HangL 研究了来自日本患者的 178 例不同的恶性肿瘤标本其中包括肺癌,发现仅有 l 例发生体细胞移码突变,因此认为 PTEN 基因突变在肿瘤的形成中不起主要作用.Remlelink 等对 57 例非小细胞肺癌 PTEN 基因突变情况的研究显示外显子 5,7 和 8 为突变高发位点,约占总突变率的 88%(21/24).Guldberg等研究表明黑色素瘤细胞系中 PTEN 基因外显子 15 的纯合性缺失率为 20%(7/35),由此导致该基因片段 mRNA 表达缺失.AnQ 等采用 RTPCR 技术检测前列腺癌细胞系 PC3 外显子卜 9,卜 8 和 5-9,
20、3 个片段,证实 3 组产物均无表达,同时基因组PCR 检测证实该细胞系 DNA 外显子 9 完全缺失,外显子 1 正常表达,证实 PC3 细胞系 PTENmRNA 表达缺失是由于该基因 3末端缺失引起的.Goncharuk等建立具有不同侵袭和转移能力的人类肺癌细胞系模型,检测 PTEN 在这些细胞系中的表达,发现外显子 5 的纯合子缺失与高侵袭力有关.在具有高侵袭力的细胞株 cL 建立组成稳定的可诱导的野生型PTEN 转染体,发现 PTEN 过表达可抑制肺癌细胞的侵袭力,该作用可能是通过下调一些基因包括整合素 a 实现的,在该研究中 ,还发现 ,PTEN 实际?上可作为调节基因,对多种物质起
21、调节作用,如PTEN 过表达可下调某些基因,包括整合素 a,层黏连蛋白 p,肝素结合表皮生长因子样生长因子,尿激酶型纤维蛋溶酶原激活剂,Myb 蛋白 B,AKT2和一些表达序列标记(EST)克隆;相反,PTEN 过20表达可上调蛋白磷酸酶 2AIB,泛素,分泌型磷蛋白 1,白细胞弹性蛋白,NFkB,环腺苷酸,环磷苷一磷酸反应成分连接蛋白,DNA 裂解酶 1,热休克蛋白 90 和一些 EST 基因,但 PTEN 与上述介质间的相互作用及与肿瘤发生之间有无关系目前还不清楚.本研究结果显示:非小细胞肺癌 PTENmRNA 表达缺失率在外显子 18 和 59 分别为 48.9%(22/45),33.3
22、%(15/45),均明显高于正常癌旁组织(尸0.05),表明 PTEN 在不同基因片段均存在转录水平的异常.总之,PTEN 基因转录水平的异常在非小细胞肺癌癌变过程中起重要作用,进一步对该基因的表达及蛋白质的表达与功能的研究,将会更深入的认识 PTEN 基因在非小细胞肺癌发生发展中的作用.3.2 不同病理类型 NSCLC 患者 PTENmRNA 表达缺失有一些研究结果提示 PTEN 基因的变异与肺癌的不同病理类型有关.YanoS 的研究发现在小细胞肺癌(SCLC)18%的细胞系和 10%的原发性肿瘤样本中存在 PTEN 点突变,小片段缺失和纯合子丢失,和 SCLC 相反,NSCLC 肿瘤或细胞系中无PTEN 基因突变,因此他认为,PTEN 突变与 SCLc 的发生有关,与 NSCLC 无关.还有研究提示在小细胞肺癌和转移性鳞癌,10q 染色体上等位
