1、1生物化学实验第一节 基本要求一、内容提要基础生物化学实验内容，主要以植物材料为研究对象。实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定，既有定性又有定量。实验内容编排不求齐全，而力求原理阐述简明扼要，通俗易懂，方法可靠，操作具体详尽，重复性好，灵敏度高。实验方法涉及传统的滴定法以及分光光度法、层析法和电泳等现代生物化学实验技术。本实验指导可供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的本、专科学生使用，也可供从事与生物科学有关的科研工作者阅读与参考。在以惊人速度发展的生物科学中，生物化学是其中最活跃的分支学科之一，它已成为发展生命科学各分支学科和生物工程技术的重要基础。作为一门
2、研究生命活动基本规律的科学，它又是一门实验科学。工业、农业、医药、食品、能源、环境科学等越来越多的研究领域都以生物化学理论为依据，以其实验技术为手段，生物化学已成为高等院校许多相关专业学生必修的专业基础课程。根据高等农业院校农学类专业教学计划，基础生物化学课程是一门重要的专业基础课；并且又是实践性极强的应用学科。只有掌握扎实而广泛的基础知识和熟练的操作技能才算真正掌握好这门应用科学。因此，我们组织编写这本基础生物化学实验指导。本实验指导主要是配合基础生物化学教材，供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的学生使用。实验多以植物材料为主要研究对象；以生物大分子碳水化合物、核酸、蛋白质和酶等为主
3、要研究内容。实验方法涉及到分光光度法、层析、电泳等现代生物化学实验技术。在实验内容编排上，既有定性的又有定量的；实验教材由基础生物化学实验和附录两部分组成。实验部分列出的实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定，有些项目包括几种不同方法，每一实验方法分为目的、原理、实验材料、仪器和试剂、操作步骤、结果计算、注意事项、思考题及参考答案。本实验指导从一定角度反映了我国生物化学研究技术目前的水平和状况，内容不求全，而力求其可靠性和方法性。在编写过程中，力求做到原理阐述简明扼要，通俗易懂，方法操作具体详尽，重复性好，灵敏度高，且注重培养学生严谨的科学态度，独立分析、解决问题的能力
4、，为提高其良好的科研素质奠定基础。本实验指导的出版是集体劳动的结晶。主要由在教学第一线多年从事基础生物化学理论与实验课教学与研究工作的教授、副教授和具有博士、硕士学位的中青年教师等共同编写。正是他们长期不懈的辛勤劳动以及在编写工作中给予的极大支持，才使本实验指导得以顺利出版。特别是陈祖洁教授始终关注本实验指导的编写进程，在百忙中审阅了全部稿件并提出许多宝贵意见。编者在此一并表示深深的谢意。由于我们的经验和水平有限，加之时间较仓促，书中难免出现不妥甚至错漏之处，我们真诚希望广大读者在参考使用中不断向我们提供宝贵的批评和建议，以臻逐趋完善。编者 于山西农业大学 2005.6.102二、实验记录及实
5、验报告每次实验要做到课前认真预习，实验操作中仔细观察并如实记录实验现象与数据，课后及时完成实验报告。1课前预习实验课前要将实验名称、目的和要求、实验内容与原理、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本中，做到心中有数。2实验记录从实验课开始就要培养严谨科学作风，养成良好习惯。实验条件下观察到的现象应仔细地记录下来，实验中观测的每个结果和数据都应及时如实地直接记在记录本上，记录时必须使用钢笔或圆珠笔，并做到原始记录准确、简练、详尽、清楚。如称量试材样品的重量、滴定管的读数、分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为 0.050，不应
6、写成 0.05。每一个结果至少要重复观测两次以上，当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。另外，实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验完成报告时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。3实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。按照实验内容可分为定性和定量两大类，实验报告的格式：实验序号，实验名称；（1）目的和要求（2）内容与原理（3）主要仪器及试剂配制（4）操作方法与实验步骤（5）结果与讨论定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而
7、必须达到的目的和要求。在完成实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。定量实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和原始数据进行认真记录、整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验
8、结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨，对于实验设计的认识、体会和3建议，对实验课的改进意见等。第二节 实验内容、方法原理及操作要领第一节 碳水化合物实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的
9、溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计） 。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。COHOHNO2O2N3,5- COHOH
10、NH2O2N 3-5-+ +三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉；精密 pH 试纸。2 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL11（2）大离心管：50mL2（3）烧杯：100mL1（4）三角瓶：100mL1（5）容量瓶：100mL3（6）刻度吸管：1mL1；2mL2；10mL1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴4（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（D
11、NS）试剂将 6.3g DNS 和 262mL 2M NaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100mL 蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250mL 70%乙醇中。（5）6M HCl 和 6M NaOH 各 100mL。四、操作步骤1 制作葡萄糖标准曲线取 7 支 20mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（
12、DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS（mL） 葡萄糖含量 （ mg）光密度值（OD-540nm）0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至 20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零
13、点，测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg ）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取 3.00g 食用面粉，放入 100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50mL 蒸馏水，搅匀，置于 50恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到 50mL 离心管中，于 4 000r/min 下离心 5min，沉淀可用 20mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集5在 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）总糖的水解和提取准确称取 1.00g 食用面粉，放
14、入 100mL 三角瓶中，加 15mL 蒸馏水及 10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解 30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查） 。待三角瓶中的水解液冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，用 6mol/LNaOH 中和至微红色，用蒸馏水定容在 100mL 容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液 10mL，移入另一 100mL 容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。（3）显色和比色取 4 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表 2 样品还原糖测定管 号 还原糖待测
15、液（mL ） 总糖待测液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS（mL） 光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算：计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。提取液总体积（ml）查曲线所得葡萄糖毫克数 测定时取用体积（ml）还原糖（%）=样品毫克数100六、附 注1离心时对称位置的离心管必须配平。2标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。3面粉中
16、还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的 ?2如何正确绘制和使用标准曲线?参考答案查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数总糖（%）=样品毫克数0.910061植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基 -5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准
17、曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。2标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边 1.52cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边 1.52cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲线上。实验二 还原糖含量测定砷钼酸比色法一、目的植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水
18、化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。二、原理还原糖是具有羰基（C=O）的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。(1)还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物砷钼蓝，其颜色深浅在一定范
19、围内与还原糖的含量（即被还原的 Cu2O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。Cu2O + H2SO4 Cu+2Cu+ + MoO42- + SO42- 2Cu2+蓝色复合物CuSO4+2NaOH Na2SO4 + Cu(OH)2O-CH-COONaO-CH-COOKCu +Cu2OH-C-OHCH=OHO-C-HH-C-OHH-C-OHCH2OH+ +H2O H-C-OHCOOHHO-C-HH-C-OHH-C-OHCH2OHHO-CH-COONaHO-CH-COOK+2HO-CH-COONaHO-CH-COOKO-CH-COONaO-CH-COOKCu
20、 +H2OCu(OH)2 +7三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料： 苹果、面粉等2主要仪器（1）分光光度计（2）水浴锅（3）具塞刻度试管：20mL10（4）刻度吸管：1 ml1，2 ml4，5 ml3（5）容量瓶：100 ml2 （6）漏斗 （7）研钵 3试剂（1）铜试剂：A、4CuSO 45H2OB、称取 24g 无水碳酸钠，用 850mL 水溶于大烧杯中，加入 2g 含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠 16g，再加入 120g 无水硫酸钠（加热） ，全溶及冷却后加水至900mL，沉淀 12d，取上清液（要求严格时过滤）备用。使用前将 A 与 B 按 19 混
21、匀即可使用。（2）砷钼酸试剂：25g 钼酸铵 ( NH4)6Mo7O244H2O 溶于 450mL 蒸馏水中（加热溶解，但温度接近 150时易分解） ，待冷却后再加入 21mL 浓 H2SO4 混匀。另将 3g 砷酸氢二钠(Na 2HAsO47H2O)溶解于 25mL 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期使用。（3）200g mL 标准葡萄糖原液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg，溶解定容到 1000mL。四、操作步骤1标准曲线的制作：在一系列刻度试管中，分别加入 200gmL 标准葡萄糖 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 及 0.6 mL，再顺序加入蒸馏水 2
22、、1.9 、1.8、1.7、1.6、1.5 及 1.4 mL，配成浓度分别为0、10、20、30、40、50 及 60g/mL的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂 2mL，混匀后沸水浴中加热 10min，立即冷却，再加入 2mL 砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到 20mL，用分光光度计在 620nm波长下比色，测其光密度 OD620nm（做一式两份） 。以糖浓度微克数为横坐标，光密度 OD620nm 为纵坐标，绘制标准曲线。2植物样品中还原糖的提取：将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取 1g 放入研钵中，加入约 0.5g 石英砂，磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗冲入 100mL 容量瓶中，加水
23、达 7080mL，摇匀后置于 80恒温水浴上浸提0.5h。待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入 5硫酸锌 5mL，再慢慢滴入 0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以8沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴 Ba(OH)2，直至无白色沉淀时，向容量瓶加水至刻度。3还原糖含量的测定：过滤上述已定容的样品液，取 5mL 滤液，再定容到 100mL（此步视样品的含糖量而定） 。取已稀释的溶液 2mL，与标准葡萄糖显色法相同：加铜试剂 2mL，煮沸 10min，加砷钼酸试剂 2mL，振荡2mL，定容到 15ml，620nm 波长下比色，记下光密度 OD620nm（至少重复两次） 。五，结果
24、计算G稀释液倍数还原糖含量()=W106式中：G从标准曲线上查得含糖量（ g）W样品重（g）六、思考题举例说明哪些是还原糖？参考答案：还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。第二节 脂 类实验一 脂肪碘值的测定一、目的掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法，了解测定脂肪碘值的意义。二、原理不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl 2，Br 2，I 2）进行加成反应。不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每 100g 脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值
25、越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反应。本实验使用 IBr 进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近理论值。溴化碘(IBr)的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。加成反应：释放碘： IBr + KI KBr + I2 滴定： I2 + 2NaS2O3 2 NaI + Na2S4O6实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表 1 与表 2：表 1 样品最适量和碘值的关系HCCH CCBrHIHBrH+9碘 值（g） 30 以下 3
26、060 60100 100140 140160 160210样品数（g） 约 1.1 0.50.6 0.30.4 0.20.3 0.150.26 0.130.15作用时间（h） 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0表 2 几种油脂的碘值名 称 亚麻子油 鱼肝油 棉子油 花生油 猪 油 牛 油碘 值（g） 175210 154170 104110 85100 4864 2541三、试剂和器材1试剂（1）溴化碘溶液取 12.2g 碘，放入 1 500mL 锥形瓶内，缓慢加入 1 000mL 冰乙酸（99.5%） ，边加边摇，同时略温热，使碘溶解。冷却后，加溴约 3mL。注意：所用冰乙酸不
27、应含有还原性物质。检查方法：取 2mL 冰乙酸，加少许重铬酸钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在。（2）0.1mol/L 标准硫代硫酸钠溶液取结晶硫代硫酸钠 50g，溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无 CO2 存在）中。添加硼砂 7.6g 或氢氧化钠 1.6g（硫代硫酸钠溶液在 pH 910 时最稳定） 。稀释到 2 000ml 后，用标准 0.1mol/L 碘酸钾溶液按下法标定：准确量取 0.1mol/L 碘酸钾溶液 20mL、10碘化钾溶液 10mL 和 1mol/L 硫酸 20mL，混合均匀。以 1淀粉溶液作指示剂，用硫代硫酸钠溶液进行标定。按下面所列反应式计算硫代硫酸钠溶液浓度后，用水
28、稀释至 0.1mol/L。KIO3 +5KI +3H2SO4 3K2SO4 +3I2 +3H2OI2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6（3）纯四氯化碳（4）1淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）（5）10碘化钾溶液（6）花生油或猪油2器材（1）碘瓶（或带玻璃塞的锥形瓶）（2）棕色、无色滴定管各 1 支（3）吸量管（4）量筒（5）分析天平四、操作步骤101准确称取 0.30.4g 花生油 2 份，置于两个干燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。加入10mL 四氯化碳，轻轻摇动，使油全部溶解。用滴定管仔细地加入 25mL 溴化碘溶液，勿使溶液接触瓶颈，塞好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴
29、 10碘化钾溶液封闭缝隙，以免碘的挥发损失。在2030暗处放置 30min，并不时轻轻摇动。油吸收的碘量不应超过溴化碘溶液所含之碘量的一半，若瓶内混合物的颜色很浅，表示花生油用量过多，改称较少量花生油，重作。2放置 30min 后，立刻小心地打开玻璃塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失。用新配制的 10碘化钾 10 mL 和蒸馏水 50mL 把玻璃塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混匀。用 0.1molL 硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。加入 1淀粉溶液约 1mL，继续滴定，将近终点时，用力振荡，使碘由四氯化碳全部进入水溶液内。再滴定至蓝色消失为止，即达滴定终点。另作 2 份空白对照，除不加油样品
30、外，其余操作同上。滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳。计算碘值。五、结果计算碘值表示 100 g 脂肪所能吸收碘的克数，因此样品碘值的计算如下：（AB）T100碘值= C式中，A：滴定空白用去的 Na2S2O3 溶液的平均毫升数B：滴定碘化后样品用去的 Na2S2O3 溶液的平均毫升数C：样品的重量（g）T：1mL 0.1mol L 硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数六、附 注（1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。（2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加 1015 mL 试剂。（3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在 CCl4 中溶解
31、不完全，可再加些 CCl4。（4）将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡不够，CCl4 展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。（5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。七、思考题1测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值间有何区别？2滴定过程中，淀粉溶液为何不能过早加入？3滴定完毕放置一些时间后，溶液应返回蓝色，否则表示滴定过量，为什么?参考答案1不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl 2， Br2，I 2）进行加成反应不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每 100g 脂肪所吸收碘的克数称为该11脂肪的
32、“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。因此，液体油的碘值应高于固体脂的碘值。2淀粉溶液不宜加得过早，否则大量的 I2 与淀粉结合成蓝色物质，这一部分碘就不容易与Na2S2O3 反应，由碘值计算公式可知，B 值减小，因而使滴定值偏高。3这是由于空气氧化 I-所引起的。如果溶液未变蓝，说明 I-被空气氧化成 I2 后，继续与 Na2S2O3发生反应，而不与淀粉反应生成蓝色，即 Na2S2O3 过量。实验二 粗脂肪含量的测定索氏抽提法一、目的脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中，测定脂肪的含量，可以作为鉴别其品质优劣的一个指标。脂肪含量的测定有很多方法，如
33、抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等。目前国内外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法（Soxhlet extractor method）是公认的经典方法，也是我国粮油分折首选的标准方法。通过本实验的学习,掌握索氏抽提法测定粗脂肪含量的原理和操作方法。二、原 理本实验采用索氏抽提法中的残余法，即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料油料作物种子、中速滤纸2仪器：（1
34、）索氏脂肪抽提器（图 1）或 YG-型油分测定器（2）干燥器(直径 1518cm，盛变色硅胶)（3）不锈钢镊子（长 20cm）（4）培养皿（5）分析天平（感量 0.001g）（6）称量瓶（7）恒温水浴（8）烘箱（9）样品筛（60 目）3试剂无水乙醚或低沸点石油醚（A.R.）四、操作步骤 1将滤纸切成 8cm8cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔编写顺序号，按顺序排列在培养皿12中。将盛有滤纸包的培养皿移入 1052烘箱中干燥 2h，取出放入干燥器中，冷却至室温。按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重（记作 a） 、称量时室内相对湿度必须低于 70。2包装和干燥在上述已称重的滤纸包中装入 3g 左
35、右研细的样品，封好包口，放入 1052的烘箱中干燥 3h，移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重（记作 b） 。3抽提将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的 1.67 倍的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在7080之间，使冷凝下滴的乙醚成连珠状（120150 滴/min 或回流 7 次/h 以上） ，抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（约需 612h） 。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发（抽提室温以 1225 为宜） 。提取瓶中的乙醚另行回收。4称重待乙醚挥发之后，
36、将滤纸包置于 1052烘箱中干燥 2h，放入干燥器冷却至恒重为止（记作 c） 。五、结果与计算bc粗脂肪含量（%）=ba100式中：a：称量瓶加滤纸包重（g）b：称量瓶加滤纸包和烘干样重（g）c：称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重（g）六、附 注（1）测定用样品、抽提器、抽提用有机溶剂都需要进行脱水处理。这是因为：第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约 2的水） ，从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。（2）试样粗细度要适宜。试样粉末过粗，脂肪不易抽提
37、干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。（3）索氏抽提法测定脂肪最大的不足是耗时过长，如能将样品先回流 12 次，然后浸泡在溶剂中过夜，次日再继续抽提，则可明显缩短抽提时间。（4）YG- 型油分测定器容量大，适合于样品较多的选种鉴定工作使用，温度控制在 70左右，8h 可提取完毕。（5）必须十分注意乙醚的安全使用。抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。乙醚中过氧化物的检查方法是：取适量乙醚，加入碘化钾溶液，用力摇动，放置 1min，若出现黄色则表明存在过氧化物，应进行处理后方可使用。处理的方法是：将乙醚放入分液
38、漏斗，先以 1/5 乙醚量的稀 KOH 溶液洗涤 23 次，以除去乙醇；然后用盐酸13酸化，加入 1/5 乙醚量的 FeSO4 或 Na2SO3 溶液，振摇，静置，分层后弃去下层水溶液，以除去过氧化物；最后用水洗至中性，用无水 CaCl2 或无水 Na2SO4 脱水，并进行重蒸馏。七、思考题1如何利用残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量？2测定过程中为什么需要对样品、抽提器、抽提用有机溶剂都要进行脱水处理？3在实验过程中安全使用乙醚应注意哪些问题？4测定样品粒子粗细有什么要求？参考答案1残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量，是用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品
39、与残渣重量之差，来计算粗脂肪含量。2进行脱水处理的原因有三：第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约 2的水） ，从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。3抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。4试样粗细度要适宜。试样粉末过粗，脂肪不易抽提干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。第三节 核 酸实验一 酵母 RNA 的提制一、目的：学习和掌握从酵母中提制 RNA 的原理和方
40、法，从而加深对核酸性质的认识。二、原理：提取和制备 RNA 的首要问题是选 RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中 RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是 RNA（2.6710.0% ） ，DNA 很少（0.030.516） ，而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。RNA 提制过程首先要使 RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将 pH 调至 2.02.5，使 RNA 沉淀，进行离心收集。然后运用 RNA不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗
41、涤 RNA 沉淀。提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使 RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但 RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解；浓盐法是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使 RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。使用浓盐法提出 RNA 时应注意掌握温度，避免在 2070之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围，会使 RNA 因降解而降低提取率。在 90100条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于 RNA 的提取。14三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料活性
42、干酵母；pH0.55.0 的精密试纸；冰块。2仪器（1）药物天平 （2）三角瓶（100mL） （3）量筒（50mL）（4）水浴锅 （5）电炉 （6）试管木夹（7）离心管 （8）离心机（4 000r/min） （9）烧杯（250mL, 50mL, 10mL）（10）滴管及玻棒 （11）吸滤瓶（500mL） （12）布氏漏斗（60mm ）（13）表面皿（8cm） ； （14）烘箱； （15）干燥器； （16）紫外可见分光光度计。3试剂（1）NaCl（化学纯）（2）6mol/L HCl（3）95乙醇（化学纯）四、操作步骤1提取活性干酵母粉 5g，倒入 100mL 三角瓶中，加 NaCl 5g，水 5
43、0mL，搅拌均匀，置于沸水浴中提取1h。2分离将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大离心管内，以 3 500r/min 离心 10min，使提取液与菌体残渣等分离。3沉淀 RNA将离心得到的上清液倾于 50mL 烧杯中，并置于放有冰块的 250mL 烧杯中冷却，待冷至 10以下时，用 6mol/L HCl 小心地调节 pH 至 2.02.5。随着 pH 下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制 pH） 。调好后继续于冰水中静置 10min，使沉淀充分，颗粒变大。4抽滤和洗涤上述悬浮液以 3 000r/min 离心 10min，得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10m
44、L 小烧杯内，用 95的乙醇 510mL 充分搅拌洗涤，然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵抽气过滤，再用 95乙醇 510mL 淋洗 3 次。由于 RNA 不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯度。5干燥从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在 8cm 表面皿上，置于 80烘箱内干燥。将干燥后的RNA 制品称重。6含量测定15称取一定量干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 1050g/mL 的溶液，在 751 型分光光度计上测定其 260nm 处的光密度值，按下式计算 RNA 含量：OD260nm RNA 溶液总体积（mL）
45、RNA 含量（%）=0.024LRNA 称取量（ g）100式中：OD260nm 为 260nm 处的光密度值；L 为比色杯的光径（cm） ；0.024 为 1mL 溶液含有 1g RNA 的光密度值。五、结果计算根据含量测定的结果按下式计算提取率：RNA 含量（%）RNA 制品量RNA 提取率（%）= 酵母重（g） 100六、思考题1RNA 提制中注意事项是什么？参考答案1主要注意事项为：避开核酸酶作用的温度范围 2070，防止 RNA 降解。同时在调 pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。此外，在抽滤洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则将导致 RNA 部分溶解而造成损失，降低
46、RNA 提取率。附 注：苯酚法提取酵母 RNA（一）原理细胞内大部分 RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取 RNA 时要把RNA 与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。本实验采用的 0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分 RNA-蛋白复合物解离，而 DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时 DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到
47、的 RNA 制品中混杂的 DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理 RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使 RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的 RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。（二）主要仪器和试剂1仪器（1）台式高速离心机（10 000r/min） （2）水浴（3）Eppendorf 管（1.5mL） （4）紫外可见分光光度计（5）冰箱或冷柜（04） （6）振荡器（7）分析天平（精确至 0.1mg） （8）真空干燥器2试剂（均为分析纯）16（1）SDS- 缓冲液：0.3 SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸钠，用乙酸调到 pH5
48、.0。（2）饱和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液饱和。（3）氯仿-异戊醇液：241（V/V ） 。（4）含 2乙酸钾的 95乙醇溶液。（5）无水乙醇（6）乙醚（7）溶菌酶（B.R.） （1mg/mL）（三）操作步骤1取 1g 活性干酵母在研钵中研碎，加 10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各 Eppendorf 管（略少于管容积的一半） ，加溶菌酶 0.1mL，混匀，室温静置 10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在 04低温环境下，10 000r/min 离心 10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿- 异戊醇，室温下剧烈振荡 2.5min，然后 10 000r/min 离心 5min。吸出上层清液，转入另一新 Eppendorf 管，加 2 倍体积 95乙醇（含 2乙酸钾） ，在冰浴中放置 30min，使RNA 沉淀。再以 10 000r/min 离心 5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各 1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。RNA 制品纯度的测定及 RNA 提取率的计算与浓盐法相同。实验二
