1、骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响?244?ChineseHeDatology,Dec2004,Vol9,No.4骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响陈宏辉张明亮阳学风严悦卿?论着?【摘要】目的通过观察酒精性肝纤维化形成过程中肝组织内骨调素和 CD68 的变化规律,探讨骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响.方法用白酒一玉米油一吡唑混合液灌胃建立酒精性肝纤维化大鼠模型.选用纯系 SD 雄性大鼠 66 只,体重 180200g,将大鼠分成 6 组(每组 11 只),A 组为正常对照组,予以正常饮食.BF组大鼠每天清早用白酒一玉米油一吡唑混合液灌胃,
2、分别于灌胃 2,4,8,12,16 周后行股静脉采血处死大鼠,并留取肝组织标本,分别测定血清肝纤维化指标(透明质酸,层粘连蛋白,型胶原);作肝组织常规苏木精一伊红,Masson 胶原,免疫组织化学染色和原位杂交技术动态观察肝组织中骨调素,CD68 表达,分布状况,定量和相关分析.结果与对照组比较,乙醇灌胃 4,8,12,16 周组大鼠骨调素,CD68 表达显着增强 ,且肝内胶原纤维含量显着增加.正常肝组织中几乎不表达骨调素,在酒精性肝纤维化大鼠模型建立过程中,从第 4 周开始中央静脉和邻近肝窦内皮细胞骨调素表达显着上调,并与胶原纤维面积百分比呈明显正相关(r=0.88),同时中央静脉和邻近肝窦
3、处浸润的巨噬细胞逐渐增多,也呈明显正相关(r=0.90).结论在酒精性肝纤维化大鼠模型中,骨调素在肝组织中显着表达 ,并可能在酒精性肝纤维化的发病过程中发挥重要作用.【关键词 1 酒精性肝纤维化;骨调素;巨噬细胞RoleofosteopontinininducingthemacrophageinfiltrationandaccumulationinexperimentalalcoholichepaticfibrosisinratCHENHonghui,ZHANGMingliang,YANGXuefeng,eta1.DepartmentofDigestion,2ndAffiliatedHospi
4、tal,NanhuaUniroersity,Henyang421001,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheroleofosteopontin(OPN)inalcoholichepaticfibrosisthroughstudychangesofOPNandCD68expressionintheliverofaratmodelofalcoholichepaticfibrosis.MethodsRatalcoholichepaticfibrosiswasinducedbyalcoholic,maizeoilandpyrazolegavage.Sixty
5、sixmaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedintocontrolgroupand5modelgroupsofalcoholichepaticfibrosisfor2,4,8,12and16weeks,withl1ratsineachgroups.Allratsweresacriricedatdifferenttime,bloodandlivertissuespecimenswereobtained.Serumfibroticmarkers(HA,LN,C)concentrationsweredeterminedrespectively.Histoc
6、hemicalstainingofformalinfixedliversectionswithHE,MassonTrichrome,andimmunohistochemicalstainingforOPNandCD68wereperformed.InsituhybridizationhistochemistrystainingofparaformaldehydefixedliversectionswithOPNmRNAwereconducted.ResultsHA,LN,PCconcentrationsin8,12and16weeksgroupswerehigherthanthoseincon
7、trolgroup(P0.01).Themorphometricmeasurementofhepaticfibrosisin4.8.12and16weeksgroupsweremarkedlyhigherthanthoseincontrolgroup(P0.01).ImmunohistochemicalstainingshowedthatexpressionofOPN,CD68in4,8,12and16weeksgroupswasincreaseddramaticallycomparedwiththatofcontrolgroup(P0.01).Insituhybridizationhisto
8、chemicalstainingshowedthatexpressionofOPNmRNAin4,8,12and16weeksgroupswerealsohigherthanthoseinconlrolgroup(P0.01).OPNexpressionwerecloselycorrelatedwithmacrophageinfiltrationandalcoholichepaticfibrosis.ConclusionExpressionofOPNwasincreaseddramaticallyintheliver,andOPNmayp1ayanimportantroleininducing
9、macrophageinfiltrationandaccumulationinratmodelofalcoholichepaticfibrosis.【Keywords】 Alcoholichepaticfibrosis;Osteopontin;Macrophage长期大量饮酒,受损肝细胞分泌细胞因子对巨噬细胞的激活,乙醇代谢产物乙醛的直接刺激,以及肠源性内毒素和其他肠源性抗原物质对巨噬细胞的刺激均作者单位:421001 湖南衡阳南华大学附属二院消化科 (陈宏辉,张明亮,阳学风);南华大学组胚教研室(严悦卿)可导致巨噬细胞活化.骨调素不仅是细胞外基质,也是很强的巨噬细胞化学趋化因子,促进巨噬细胞
10、粘附聚集.目前,国内外研究发现,在肾小管间质炎症,损伤和纤维化及肺纤维化有关的实验动物模型中,均有骨调素的过度表达一.我们通过观察酒精性肝纤肝脏 2004 年 12 月第 9 卷第 4 期维化形成过程中肝组织内骨调素和 CD68 的变化规律,初步探讨骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响.材料和方法一,主要材料(一)实验动物 SD 雄性大鼠,体重 180200g,购自中山医科大学动物实验部.(二)主要试剂透明质酸 (HA),层粘连蛋白(LN),IV 型胶原(CIV)放射免疫试剂盒购自上海海军医学研究所.羊抗大鼠骨调素抗体为美国 SantaCruz公司产品,购于上海康成生物工程有限
11、公司,兔抗大鼠CD68 抗体,骨调素原位杂交检测试剂盒,SABC 及SABC-AP 免疫组织化学染色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司.吡唑为 Sigma 公司产品,购自北京中山生物公司.二,实验方法(一)酒精性肝纤维化大鼠模型的建立与分组选用清洁级纯系 SD 雄性大鼠 66 只,分成 6 组(每组11 只),A 组为正常对照组,予以正常饮食.BF 组大鼠每天清早用白酒(56 度)一玉米油一吡唑混合液灌胃.另外间断给予高脂饲料,其中酒的摄入量为每天812g/kg,随时间延长而递增,玉米油摄入量为每天2g/kg,吡唑摄入量为 24mg/kg.造模过程中不断观察动物一般状况及体重变化,并每周称
12、重 1 次,根据体重调整酒,玉米油,吡唑的摄入量.B,C,D,E,F 组分别于灌胃 2,4,8,12,16 周后行股静脉采血,处死大鼠,并留取肝组织标本,分别用 10%甲醛和 4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)固定.(二)纤维化程度评价苏木精一伊红和 Masson三色胶原染色,光镜下观察,Masson 三色胶原染色结果用图像分析仪分析,自动测量并计算测定胶原纤维面积百分比(胶原纤维面积/肝组织面积100%),取平均值.(三)骨调素,CD68 免疫组织化学染色标本石蜡包埋,4gm 连续切片,采用 SABC 法作免疫组织化学染色,阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗,其他条件均相同.阳性细胞的
13、胞质或胞膜染色为棕褐色.采用计算机图像分析系统,以胞质内或胞膜上棕褐色颗粒为阳性信号,自动测量并计算阳性信号积分吸光度(A).(四)骨调素 mRNA 原位杂交石蜡包埋,7gm连续切片,采用针对大鼠骨调素 mRNA 的寡核苷酸探针,经地高辛标记的原位检测方法.阴性对照以预杂?245?交液替代杂交液而其他条件均相同.阳性细胞的胞质或胞膜染色为棕褐色.采用计算机图像分析系统,以胞质内棕褐色颗粒为阳性信号,自动测量并计算阳性信号积分吸光度(A).(五)骨调素,CD68 免疫组织化学双重染色标本石蜡包埋,4gm 连续切片,采用洗脱法作免疫组织化学双重染色.骨调素阳性细胞染色为蓝紫色,CD68阳性细胞染色
14、为红色.三,统计方法计量资料以S 表示,组间差异采用单因素方差分析(onewayANOVA),两两比较采用最小显着(1eastsignificantdifference,LSD)法检验.所有数据均利用 SPSS10.0 软件分析.结果一,纤维化程度评价光镜显示,对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,具有正常的多边形细胞形状和结构,胞质丰富,细胞核圆形,肝小叶呈类圆形体;乙醇摄入 2 周末 ,见肝细胞明显肿胀,部分细胞内可见数量较多而不等,大小不一的脂肪滴,细胞质呈疏松状,或肿胀为气球状(气球样变);4 周末,肝细胞呈中重度脂肪变性 ,8周末肝细胞变性坏死,炎性细胞浸润,Masson 三重染
15、色可见胶原于中央静脉沉积增加,12 周末变性坏死及炎性细胞浸润明显,Masson 三重染色可见胶原自中央静脉向窦周隙伸展,呈现轻度肝纤维化改变,16 周末可见更广泛的中央静脉和小叶间纤维化.二,酒精性肝纤维化形成过程中血清肝纤维化指标变化对照组,乙醇灌胃各组大鼠血清 HA,LN 及 C检测结果见表 1.表 1 酒精性肝纤维化形成过程中血清肝纤维化指标的变化与对照组比较 P0.O1三,肝组织中骨调素表达正常肝组织中几乎不表达骨调素.在酒精性肝纤维化大鼠模型的建立过程中,从第 4 周开始中央静脉?246?及其周围肝窦内皮细胞骨调素表达显着上调,并随病情发展而升高.肝组织中骨调素免疫组织化学染色,骨
16、调素 mRNA 原位杂交结果见表 2.表 2 胶原纤维面积分比,骨调素免疫组织化学,mRNA 原位杂交检测结果()与对照组比较P001四,肝组织 CD68 的表达对照组大鼠肝组织中 CD68 细胞(巨噬细胞)主要分布于靠近汇管区的肝窦内.而在中央静脉周围肝窦内很少,在酒精性肝纤维化大鼠模型建立过程中,大鼠肝组织 CD68 细胞逐渐增多,以中央静脉及其周围肝窦内为着.肝组织 CD68 免疫组织化学染色 A 值见表 3表 3 肝组织中 CD68 检测结果(S)与对照组比较 P001五,骨调素,CD68 免疫组织化学双重染色酒精性肝纤维化大鼠模型中,骨调素表达显着上调的中央静脉及其周围的肝窦内皮细胞
17、区域,可见CD68 巨噬细胞明显聚集.六,骨调素与胶原纤维面积百分比,巨噬细胞浸润的相关分析我们的研究结果显示,在酒精性肝纤维化大鼠模型建立过程中,骨调素表达强度与胶原纤维面积百分比呈明显正相关(r=0.88),浸润的巨噬细胞 CD68 的表达强度也呈明显正相关(r=0.90).讨论在西方国家,乙醇中毒占肝硬化的 80%,我国酒ChineseHepal,坚.4精性肝病的发病率也日渐升高长期大量饮酒,使受损肝细胞激活巨噬细胞,而后者可释放各种细胞因子(如白细胞介素一 l 等) 并调节肝细胞蛋白合成 .巨噬细胞毒性产物可致肝细胞气球样变以至死亡,通过所分泌的细胞因子肿瘤坏死因子 Ot 等介导肝细胞
18、凋亡一.肝细胞和巨噬细胞在 HSC 活化过程中具有协同作用.研究证明,先用肝细胞条件培养基,再用巨噬细胞培养基作用 HSC,可提高对 HSC 的促增生作用.将两种培养基混合作用,不但可以诱导 HSC 向肌成纤维细胞转化,还可极大地增加 HSC 蛋白多糖,纤维蛋白等合成.我们在研究中发现,在酒精性肝纤维化大鼠模型的建立过程中,随着中央静脉和邻近肝窦内皮细胞骨调素表达显着上调,中央静脉和邻近肝窦处浸润的巨噬细胞逐渐增多,呈明显正相关(r:0.90), 提示酒精性肝纤维化形成过程中骨调素的表达显着上调,导致巨噬细胞浸润,聚集,活化,巨噬细胞激活后,分泌的多种细胞因子如 TGFa,TGFf3 和 PI)(F 可刺激 HSC 活化增生,细胞外基质合成增加,肝组织中胶原纤维明显增加,引起酒精性肝纤维化.在酒精性肝纤维化发生,发展过程中,骨调素表达明显增高,并与巨噬细胞在肝组织中的浸润及肝组织的纤维化具有密切的关系.参考文献一一一一一一一一一一一一一一一
