1、脂多糖结合蛋白与 CD14 基因多态性分布及其意义初步探讨.320.中华老年多器官疾病杂志 2007 年 lO 月第 6 卷第 5 期ChinJMuItOrganDisElderlyOct2007Vol6No5临床研究脂多糖结合蛋白与 CD14 基因多态性分布及其意义初步探讨蔺静姚咏明黄志红于燕柴家科于勇【摘要】目的通过探讨脂多糖结合蛋白(LBP)Leu436-Phe 基因多态性对 CD14合成与释放的影响以及CD14C-159T 对 LBP 蛋白浓度的调节效应,阐明这两种基因多态性的可能作用机制.方法研究对象为 118 例健康献血员及 26 例烧伤面积30 的患者,采用限制性片段长度多态性分
2、析LBPLeu436-Phe 及 CD14C-159T 基因多态性,同时检测 CD14mRNA 表达,可溶性 CD14(sCD14)及 LBP 浓度.结果体外全血培养实验中,脂多糖刺激与否,LBPLeu436 一 Phe 对 CD14mRNA 表达,sCD14 水平均无明显影响(P0.05),CD14159 位点基因型也与LBP 浓度无关 (P0.05).而对烧伤面积30 的患者研究显示 ,CD14159 位点 TT 基因型患者 LBP 浓度于伤后第 3,21 天明显高于 CC 基因型(P0.05).结论 CD14C-159T 基因多态性可能通过间接调节机制影响 LBP 产生,并与严重烧伤患者
3、预后不良有关.【关键词】烧伤;脂多糖类;抗原,CD14;基因多态性Thedistributionandpotentialsignificanceoflip0p0lysaccharidebindingproteinandCD14genepolymorphismLINJing,YAOYongming,HUANGZhihong.etalBurnsInstitute,FirstHospitalAffiliatedtothePLAGeneralHospital(formerly304thHospita1),Beijing100037,ChinaAbstractObjectiveTodetermineth
4、epossiblemechanismofIipopolysaccharidebindingprotein(LBP)Leu436-,-PheandCD14C-159TgeneticpolymorphismintermsoftheinfluenceofLBPLeu436,PhegeneticpolymorphismonlipopolysaccharidereceptorCD14geneexpressionaswellasproteinrelease.andthepotentialregulatingeftectofCD14C-159TonLBPlevels.MethodsThestudygroup
5、consistedof118healthyblooddonorsand26patientswithburnscoveringmorethan30oftotalbodysurfacearea.TheLBPandCD14geneticpolymorphismsweredetectedbyrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis.Meanwhile,theCD14mRNAexpression,solubleCD14(sCD14)andIBPlevelsweredeterminedwithEIISAmethods.ResultsIBPLeu436Phe
6、hadnomarkedinfluenceonCD14mRNAexpressionaswellasCD14levels(allP0.05),andthegenotypeofCD14atposition 一 159sitewasnotrelatedtoIBPlevelsininvitrowholebloodculturewithorwithouthpopolysaccharidestimulation(100gg/Ifor12h).However,inpatientswithburnscoveringmorethan30oftotalbodysurfacearea.TTgenotypeshowed
7、significantlyhigherIBPlevelsthanCChomozygotesondays3and21postburn(P0.05),ConclusionCD14C 一159TpolymorphismmightaffectLBPproductionindirectlythroughtheactionofcytokines,whichappearstobeassociatedwiththepooroutcomeofpatientswithmajorburns.Keywordsburnshpopolysaccharide;antigen,CD14;geneticpolymorphism
8、脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)是介导革兰收稿日期;20060804基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(2OO5CB5226O2); 国家杰出青年科学基金资助项目(30125020);北京市科技计划重大项目(H020920020530);首都医学发展基金重点项目(20032023)作者单位;100037 北京市,解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所作者简介;蔺静,女,1971 年 12 月生,北京市人,在读博士研究生 ,主治医师.通迅作者:姚咏明,Tel:010 66867394,E-mail:c_ffsina.corn阴性菌脓毒症(sepsis)及多器官功能障碍综
9、合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)的重要致病因子,通过与脂多糖结合蛋白(1ipopolysaccharidebindingprotein,IBP)形成 LPSLBP复合物并与细胞表面受体 CD14 分子作用,从而激活细胞内炎症信号转导通路.LBP/CD14 作为内毒素反应的增敏系统,参与了革兰阴性菌脓毒症和多器官损害的病理生理过程.笔者既往研究表明,中华老年多器官疾病杂志 2007 年 1O 月第 6 卷第 5 期ChinJMuhOrganDisElderlyOct2007Vol6No5?321?LBPPhe436Leu,CD14C-159T 基
10、因多态性分别与LBP 浓度,CD14mRNA 表达有关 .由于信号分子之间存在交互作用,LBPPhe436Leu 是否会影响 CD14 表达,LBP 合成又是否受到 CD14159 位点基因型的反馈调节尚不清楚,笔者通过体外,体内实验对此进行了初步探讨.1 对象与方法1.1 研究对象(1)体外实验:l18 例健康献血员,汉族,男 102 例,女 16 例;年龄 1851 岁,平均(23.74.7)岁 .试验前经检查未发现任何慢性疾病且未服用任何药物.无菌收集乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝全血标本,取 lml 全血培养,100ug/L 内毒素刺激,另取 1ml 全血培养不加内毒素刺激,12
11、h 后分离上清及细胞并于一 70保存 l_3.(2)临床试验:26 例热力烧伤总面积 30 的患者来源于解放军总医院第一附属医院烧伤研究所和北京军区总医院分院烧伤科,其中男 23 例,女 3 例;年龄 1957 岁.分别于伤后 24h 内,第 3,7,14,21,28 天无菌操作收集 EDTAK.抗凝全血标本(受检前经医院医学伦理委员会批准,并签署志愿接受医学实验知情同意书).1.2LBPLeu436-Phe 及 CD14C_159T 基因多态性分析(1)基因组 DNA 的提取 :采用北京赛百盛基因技术有限公司的 UltraPure 州基因组 DNA 提纯试剂盒,严格按照说明书进行操作.(2)
12、LBPLeu436-Phe 基因多态性分析 l_4:LBP 基因 PCR 扩增的正向引物为 5.TCCTCAACTATTACATCCTTAAGGCC 一 3,反向引物为 5.TTTCCTCCAGACAGCAGTGTTCAC 一 3.PCR 反应条件为:95预变性 1.5min,然后 93oC20s,5630s和 7230s,35 个循环后 72延伸 10min.PCR 反应产物为 102bp.取 6lPCR 产物与限制性核酸内切酶 StuI(购自美国 Promega 公司) 于 37温育 4h.Phe436 纯合子产生 78bp 和 24bp 两个片段;杂合子产生 102bp,78bp 和 2
13、4bp 三个片段;Leu436 纯合子只有 102bp 一个片段.酶切产物于4 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下判定结果.取 40 份 DNA 样本测序,进行基因型验证.(3)CD14C 一 159T 基因多态性分析 l5:CD14 基因启动子 PCR 扩增的正向引物为 5.TGCCAGGAGACACAGAACCC 一 3,反向引物为 5.TGTCATTCAGTTCCCTCCTC 一 3,.PCR 反应条件为:96预变性 3rain,然后 9640S,5640S 和 7250S,38个循环后 72延伸 10min.PCR 反应产物为166bp.取 6tAPCR 产物与限制性核酸内切酶 H
14、aem(购自美国 Promega 公司)于 37温育 4h.Hae识别位点为 5.GGCC 一 3,纯合子 CC 产生 115bp和 51bp 两个片段;杂合子 TC 产生 166bp,115bp和 51bp 三个片段;纯合子 TT 只有 166bp 一个片段.酶切产物于 4 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下判定结果.取 40 份 DNA 样本测序,进行基因型验证.1.3CD14mRNA 表达检测提取烧伤患者外周血白细胞总 mRNA(美国 Promega 公司产品), 采用逆转录 PCR 技术检测 CD14mRNA 的表达,以一actin 作为内参对照.人 CD14 扩增片段引物正义链为
15、:5,_GGTGCCGCTGTGTAGGAAAGA 一3,反义链为:5.GGTCCTCGAGCGTCAGTTCCT 一 3,l;人 13-actin 扩增片段引物正义链为 :5,_GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 一 3,反义链为:5一 GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 一 3.扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后照相,照片采用 LEICAQ 一 500IW 图像分析处理系统进行分析,采用目的基因与内参对照的积分光密度比值表示 mRNA 相对表达量.1.4LBP 及 sCD14 蛋白水平检测采用酶联免疫吸附试验(ELIsA)检测烧伤患者血清 LBP 及可溶性 CD14(
16、sCD14)浓度.所用人 LBPELISA 检测试剂盒(荷兰 ,Hbt 公司), 灵敏度为 lug/L,人 sCD14ELISA 检测试剂盒( 德国 IBL 公司产品), 灵敏度为0.24ug/L.严格按照试剂盒说明书进行操作,计算出标准曲线回归方程,将样品光密度值代入标准曲线,并乘以相应的稀释倍数,计算出样品的含量.1.5 统计学处理观察指标以平均值标准差(S)表示,采用 SPSS11.0 统计软件进行检验 ,t检验和单因素方差分析,P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1CD14159 位点基因多态性的分布 l18 例健康献血员中 40 例为 T 等位基因纯合子,62 例为 TC杂合
17、子,C 等位基因纯合子有 16 例.26 例烧伤患者检出 8 例 TT 纯合子,14 例 TC 杂合子,4 例 CC纯合子.DNA 测序结果见图 1,2.2.2LBPLeu436-Phe 基因多态性的分布 1l8例健康献血员中,检出 Phe436 纯合子 104 例,杂合子 14 例,未检出 Leu436 纯合子.26 例烧伤患者中322 中华老年多器官疾病杂志 2007 年 10 月第 6 卷第 5 期ChinJMuItOrganDisElder1yOct2007vo16No5AGGGGGACAGGGGGNCAGGGGGGCTAG从左至右依次为 TT,TC,CC 基因型反方向(3一 5)DN
18、A 序列图 1CD14 基因测序结果JAAGGGTAGPhe/PheANGGGPhe/Leu从左至右依次为 Phe/Phe(ttc/ttc)及 Phe/Ieu(ttc/ctc)基因型反方向(3 一 5)DNA 序列图 2LBP 基因测序结果只有 1 例为杂合子,其余均为 Phe436 纯合子.2.3LBPPhe436Leu 基因多态性对 CD14mRNA表达及 sCD14 浓度的影响全血细胞体外培养,LPS 刺激组及未刺激组,在 CD14159 位点基因型相同的情况下,LBPPhe436Leu 基因多态性对CD14mRNA 表达及 sCD14 水平均无明显影响(P0.05,表 1,2).2.4
19、CD14C159T 基因多态性对 LBP 浓度的影响全血细胞体外培养,LPS 刺激组及未刺激组 ,CD14C 一 159T 基因多态性对 LBP 浓度影响均不明显(P0.05,表 3).2.5 烧伤患者 CD14C-159T 基因多态性对 LBP浓度的影响 CD14-159 位点三种基因型 LBP 浓度到达峰值及持续时间有所不同.TT 及 TC 基因型于伤后第 3 天即达到较高水平,并且一直持续至伤后 3 周之后,而 CC 纯合子第 7 天才明显升高,仅持续了 2 周时间便明显下降.其中伤后第 3 天和第21 天,TT 纯合子患者血浆 LBP 浓度明显高于 CC纯合子(P0.05,表 4).2
20、.6 烧伤患者血浆 LBP 浓度与预后的关系伤后3 周内死亡患者 LBP 浓度均高于存活患者,其中伤后第 14,21 天存在显着性差异(P0.05,表 5).中华老年多器官疾病杂志 2007 年 10 月第 6 卷第 5 期ChinJMuhOrganDisElder1yOct2007Vo16No5.323.TT(n=8)28.2511.7454.4030.8555.9318.5155.9125.O149.716.3246.9811.43TC(n=14)30.039.8949.9617.5854.751O.8447.08+11.9144.19 士8.O546.4718.68CC(n-4)20.1
21、43.2732.7610.7547.9620.1051.O628.1136.0217.7536.4618.95注:与存活组相应时间比较,PO.053 讨论脓毒症及 MODS 的发生与糖尿病,哮喘或高血压等常见多基因疾病相似,不遵循孟德尔遗传表型基因型的规律,难以用一般的家系遗传连锁分析取得突破,而受到多基因调控.多基因疾病是由多个微效基因的累加作用和某些环境因子作用所致,其发生和发展是多基因或多通路间平衡失调的结果.因此,脓毒症和 MODS 的发生与其调节通路中候选基因的相互作用以及炎症反应的网络调控密不可分.LPS 作为革兰阴性菌内毒素的主要成分及致病因子,系脓毒症及 MODS 的重要诱发因
22、素.由于LBP 与 CD14 在 LPS 诱导的信号通路中存在密切联系,LBPPhe436Leu 与 CD14C 一 159T 基因多态性是否分别对 CD14 以及 LBP 表达产生交互影响,目前尚不清楚.本组资料中,体外全血培养实验证实IBPPhe436Ieu 多态性与 CD14mRNA 表达及sCD14 水平无关,而且 CD14C159T 多态性也未明显影响 IBP 浓度 .然而不能忽视的是 ,上述结果很可能与 LBP 浓度在体外 IPS 刺激组与未刺激组并未发生显着变化有关.虽然有研究表明,IBP 除主要由肝细胞合成外,少部分可在肝外组织(如肺,肠,肾等)合成 _9,但尚未见在白细胞中合
23、成的相关报道,并且笔者体外实验结果也证实了白细胞中 IBPmRNA 表达为阴性 l1.因此体外细胞培养只能反映 IBP 生理浓度时 LBPPhe436Ieu 多态性与CD14mRNA 表达及 sCD14 水平无关,CD14C 一159T 基因多态性对 IBP 浓度没有明显影响也只能反映 IPS 未刺激组的状况.鉴于体外实验的缺陷,笔者进一步以大面积烧伤患者为研究对象,探讨 CD14159 位点基因型与?324?中华老年多器官疾病杂志 2007 年 lO 月第 6 卷第 5 期ChinJMultOrganDisElderlyOct2007Vol6No5LBP 血浆浓度之间的关系.由于 26 例烧
24、伤患者中仅 1 例为 Phe/Leu 杂合子 ,其余均为 Phe/Phe 纯合子,因此暂不能用以分析 LBPPhe436Leu 多态性对CD14 表达的影响.本临床观察显示,烧伤后第 3,21 天,TT 基因型患者 LBP 浓度明显高于 CC 纯合子,且峰值持续时间较长.因此 CD14-159 位点多态性可能间接影响 LBP 蛋白浓度.据报道,LBP 的合成受到白细胞介素一 6(IL 一 6)水平的调节,用 IL 一 6刺激人 HepG2 细胞,第 1 天 LBP 的合成量高于基础值 10 倍,第 2 天高于 100 倍_l.笔者既往研究发现,CD14C 一 159T 基因多态性不仅与 CD1
25、4 表达有关,而且与 IL 一 6 水平有关 ;体外全血细胞 LPS 刺激后,TT 纯合子与 TC 杂合子上清液中 IL 一 6 水平明显高于 CC 纯合子 ll.可以推测,CD14C 一 159T基因多态性可能通过调控其下游信号通路中炎症因子 IL 一 6 的水平 ,从而影响肝脏等器官合成分泌IBP.升高的 LBP 与 CD14 相互作用,实现对 LPS刺激的增敏效应,由此信号通路的正反馈调节对炎症反应起到放大作用_1 引.本组临床资料显示,死亡患者伤后第 14,21 天LBP 浓度明显高于存活患者.与此结果相一致的是血中 sCD14,肿瘤坏死因子一 a(tumornecrosisfacto
26、ra,TNFa)浓度愈高, 患者易于并发 MODS,其预后愈差.因此,CD14-159 位点多态性通过调节 CD14 表达,进而影响 sCD14,TNFd 及 LBP浓度,对烧伤后患者并发脓毒症,MODS 和预后不良起到促进作用.而 LBPPhe436Leu 多态性的确切临床意义尚待大宗临床病例深入探讨.1E22E32参考文献蔺静,姚咏明,成力明,等.脂多糖结合蛋白(LBP)基因多态性对 IBP 及细胞因子诱生的影响 .中华实验外科杂志,2005,22:14251426.蔺静,姚咏明,黄志红,等.CD14-159C/T 基因多态性对全血培养 CD14 表达的影响.中华外科杂志,2005,43:10241027.LouisE,FranchimontD,PironA,eta1.Tumournecrosisfactor(TNF)genepolymorphisminfluencesTNFalphaproductioninlipopolysaccharide(LPS)一
