1、酶免疫测定技术,广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇,概述,1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术 2 标记免疫技术的分类： 按标记物分类：同位素标记荧光素酶标记 等等 按检测对象分类：免疫组织化学技术免疫测定技术,酶免疫测定技术 概述： 1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。 2.分类：酶免疫组化酶免疫
2、测定 均相法 异相法 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法 则需分离后测定,均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术): 2.克隆酶供体免疫测定 ：,位阻,ED,ED,EA,EA,ED,Ab,Ab,活性酶,标本中Ag,酶联免疫吸附试验(ELISA),第一节ELISA的原理和类型 一、基本要求： 1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。 免疫吸附剂 2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。 酶结合物 3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物
3、后能产生有色反应。 底物,二、必备试剂： 固相的Ag或Ab-免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag-结合物 酶反应的底物-底物 三、方法类型： 夹心法 间接法 竞争法 捕获法测IgM抗体,标本,标本,酶标抗体,底物,显色 有色为阳性,显色 有色为阳性,酶标二抗,底物,3.竞争法 Ag AgAb+ AbAg(标本) (定量) AgAb,E,E,终止液,标本,酶标抗体,底物,显色,显色,固相,固相,标本,酶标二抗,底物,1.夹心法,2.间接法,第二节 ELISA的技术要点 一、试剂制备 免疫吸附剂 酶标记抗原或抗体 二、反应条件的选择 酶标二抗浓度选择 包被抗原浓度的选择 三、操作标准化,一、试剂制备：
4、免疫吸附剂 固相载体 要求： 吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 载体性能比较 载体材料：+、- 结果差别大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。, 常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法 封闭：包被后在用15%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰。, 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2
5、. ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色：DAB(棕黄色) -萘酚(红色)，3-氧基-9-乙基卡唑(红色)4-氯-1-萘酚(灰蓝色),AP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光Ap不可溶性底物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色坚固红和萘酚ASMX混合液：红色-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光
6、4. 酶结合物的制备： 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,二、反应条件的选择 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标二抗，取OD=0.8者。 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 温度、时间等三、操作标准化1 加样2 保温3 洗涤4 比色,四、影响ELISA测定的因素：试剂盒因素 实验操作中的影响,试剂盒因素： A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好) E 运输储存,操作中的注意事项： 1 标本的收集和
7、保存 试剂的准备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判断,样品的收集和保存：1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用于HRP的辅基)。2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白) 。3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增 加。5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。,试剂的准备：注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37的时间差异，对弱阳性结果有很大影响。,加样：总体积约360ul，包被和封闭均为100ul，未封闭部分可吸附非特异蛋白,温育：4过夜最佳， 372h较好，4320min可造成弱“+”假“-”
8、 2 水浴较温箱等空气浴均匀,洗板：手洗效果最佳自动洗板要注意残留液量。,显色对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%,易造成弱“+”假“-”,比色：单波长比色需设空白孔：OD=OD样品-OD空白 双波长比色不需设空白：OD=OD450nm-OD630nm,结果判断：1 注意夹心法假“-”2 用cut-off(CO)值判断3 “灰区”时建议动态观察4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg,五. ELISA出现“一片黄”的原因：酶结合物浓度过高底物不新鲜洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因：载体吸附性能差 底物错稀释液作包被液加错试剂包被时间过短酶活力低或下降样品含有NaN3。,第三节 酶标记技术的发展 一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统,
