1、桑叶成分测定方法茶多酚的测定（GB/T 8313-2002）本标准适用于茶叶中茶多酚的测定，不适用于茶叶提取物制品中茶多酚的测定。引用标准：GB/T 8302-2002 茶取样；GB/T 8312-2002 茶咖啡碱测定；GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；茶多酚（tea polyphenols）：茶叶水浸出物中与亚铁离子产生络合反应的酚类物质。原理：茶叶中多酚类物质能与与亚铁离子形成紫蓝色络合物。用分光光度法测定其含量。设备：分析天平、分光光度计。试剂和溶液：水为蒸馏水。1、酒石酸亚铁溶液：称取 1g (准确至 0.0001g) 硫酸亚铁和 5g (准确至0.0
2、001g)酒石酸钾钠，用水溶解并定容至 1L(溶液应避光，低温保存，有效期一个月)。2、pH7.5 磷酸盐缓冲液：1/15mol/L 磷酸氢二钠: 称取 23.9g 十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容至 1L。1/15mol/L 磷酸二氢钾：称取经 110 度烘干 2h 的磷酸二氢钾 9.08g，加水溶解后定容至 1L。取上述磷酸氢二钠溶液 85ml 和磷酸二氢钾溶液 15ml 混合均匀。操作方法1 取样：按茶 取样的规定取样。2 试样的制备：按茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定 GB/T 8303-2002的规定，制备试样。3 测定步骤：(1)试液的制备：按茶 水浸出物测定 GB/T 83
3、12-2002中的 11.1 的规定，制备试液。 (2)测定：准确吸取上述(1)试液 1mL，注入 25mL 的容量瓶中，加水 4mL和酒石酸亚铁溶液 5mL，充分混合，再加 pH7.5 的缓冲液至刻度，用 10mm 比色杯，在波长 540nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度 (A)。 4、结果计算：计算方法和公式茶叶中茶多酚的含量，以干态质量百分率表示，按下式计算： 茶多酚(%)=【(A1.9572)/1000】【L1/(L2M 0m)】100式中： L1试液的总量，mL； L2测定时的用液量，mL； M0试样的质量，g； m试样干物质含量百分率，%； A试样的吸光度； 1.957用
4、10mm 比色杯，当吸光度等于 0.50 时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于 1.957mg。5、如果符合重复性的要求，则取两次测定的算术平均值作为结果。 重复性同一样品的两次测定值之差，每 100g 试样不得超过 0.5g。茶游离氨基酸总量的测定（GB/T 8314-2002）本标准适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定。引用标准：GB/T 8302-2002 茶取样；GB/T 8312-2002 茶咖啡碱测定；GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；GB/T 8313-2002 茶茶多酚测定定义：游离氨基酸 free amino acids：茶叶水浸出物中呈游离状态存在的具
5、有 a-氨基的有机酸。原理：a-氨基酸在 ph8.0 条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定波长下测定其含量。仪器和用具：分析天平；分光光度仪。试剂和溶液：所用试剂应为分析纯，纯度不低于 99%，水为蒸馏水。1、pH8.0 磷酸盐缓冲液：1/15mol/L 磷酸氢二钠：称取 23.9g 十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容至 1L。1/15mol/L 磷酸二氢钾：称取经 110 度烘干 2h 的磷酸二氢钾 9.08g，加水溶解后定容至 1L。取上述磷酸氢二钠溶液 95ml 和磷酸二氢钾溶液 5ml 混合均匀。2、2% 茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2g，加 50ml 水和 80mg
6、 二水合氯化亚锡搅拌均匀。分次加少量水溶液，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至 100ml。3、茶氨酸或谷氨酸标准液：称取 100mg 茶氨酸或谷氨酸溶于 100ml 水中，作为标准吸取 5ml 母液，加水定容 50ml 作为工作液（1ml 含茶氨酸或谷氨酸 0.1mg） 。操作方法：1、取样： GB/T 8302-20022、试样制备： GB/T 8303-20023、测定步骤：3.1 试液的制备： GB/T 8312-2002 中 11.1 的规定。3.2 测定：准确吸取试液（3.1）1ml，注入 25ml 的容量瓶中，加 0.5ml pH8.0 磷酸盐缓冲液和 0.5ml 2%茚三酮
7、溶液，在沸水中加热 15min。待冷却后加水定容至 25ml。放置 10min 后，用 5mm 比色杯在 570nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度 A。3.3 氨基酸标准曲线的制作：分别吸取 0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml 茶或谷氨酸工作液于一组25ml 容量瓶中，各加水 4ml， pH8.0 磷酸盐缓冲液 0.5ml 和 2%茚三酮溶液 0.5ml，在沸水中加热 15min。待冷却后加水定容至 25ml。放置 10min后，用 5mm 比色杯在 570nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。将测得的吸光度与对应的茶或谷基酸浓度绘制标准曲线。4、结果计算：计算方法
8、和公式茶叶中游离氨基酸含量，以干态质量分数表示，按下式计算： 游离氨基酸总量(以茶氨酸或谷氨酸计%)=【(C/1000)（L1/L2） 】/ 【M 0m)】100式中： L1试液总量，mL； L2测定用试液量，mL； M0试样的质量，g； m试样干物质含量百分率，%； C根据测定吸光度从标准曲线上查的的茶氨酸或谷氨酸的毫克数。5、重复性：同一样品的两次测定值之差，每 100g 试样不得超过 0.1g。采用比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，测定原理为：氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解产生CO 、氨和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。在弱酸性溶液中，还原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成
9、蓝紫色化合物茚二酮胺(DYDA)DYDA在570nm处有最大吸收。采用茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，确定以茶氨酸为标准的最佳反应条件。结果表明，反应 pH 为 80，缓冲液和显色剂的用量为05mL ，沸水浴加热 15min，冷却 10min 后加水定容到 25mL 在最大吸收波长570nm 处测定吸光度。1 试验方法1.1 茶氨酸标准溶液的配制：准确称取100mg茶氨酸 (纯度不低于99)溶于100mL水中，作为母液，准确吸取5mL母液，加水定容至50mL，作为工作液(1mL含茶氨酸01mg) ； 2茚三酮溶液配制：称取水合茚三酮(纯度不低于99)2g ，加50mL 水和80mg氯化亚
10、锡(SnC1 2H O)搅拌均匀，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100mL。1.2 样品处理：称取3g(精确到00001g)粉碎混合均匀过60目筛样品于500mL锥形瓶中，加450mL煮沸蒸馏水，沸水浴锅中浸提45min，减压过滤至500mL容量瓶中，残渣用热蒸馏水洗涤23次，冷却，定容 。1.3 显色条件的选择：配制不同浓度的茶氨酸标准溶液和不同pH 的缓冲溶液。反应体系：取一定体积的待测溶液+0.5 mLpH80 的磷酸盐缓冲液+0.5 mL 2茚三酮的溶液，水浴加热，冷却蒸馏水定容至25mL，在570nm处测定吸光度。研究不同pH、显色剂用量、加热时间和冷却时间对吸光度的影响。结
11、论：PH8.0，显色剂的用量为0.5mL，：加热15min时有最大吸光值。桑叶中微量元素的测定1. 1 预处理将桑叶洗净, 在干燥箱中于60干燥至恒重, 粉碎, 过60目筛。1. 2 样品处理精确称取桑叶2.0000g, 置于坩埚, 在电炉上低温炭化至无烟, 固体表面有一层白色状。然后转入马弗炉中, 于500-550条件下灰化5h，取出冷却1 。1. 3 样品的消化样品用18mL 浓HNO 3 消化24h, 然后加入3m1H 2O2 于电炉上加热30min, 至HNO3 分解完全, 转入微波消解罐中, 微波消解9min, 取出。冷却后转移至50mL容量瓶, 用二次水定容，摇匀，过滤2 。1.
12、4 测定将上述样品用原子吸收分光光度计分别测定K、Ca、Na、M g、Mn、Fe、Cu 、Zn 、Cr、Pb、Co 、Ni 12 种微量元素的含量。结果见表1。表1 桑叶中必须微量元素的含量元素 K Ca Na Mg Fe Mn Zn Ni Cu Co Cr Pbug/g 31582 10817 202.25 3035 339.25 50.53 49.625 4.44 12.3 0.585 0.12 -桑叶中富含人体必须的微量元素, 种类较齐全, 其中K 、Ca 、Mg 含量丰富, 其他微量元素含量顺序为Fe Na Mn Zn Cu Ni Co。有害元素Cr, Pb均低于国家限定标准。桑叶中总
13、黄酮含量的测定2. 1 预处理将桑叶洗净, 在干燥箱中于60干燥至恒重, 粉碎, 过60目筛。2. 2 超声波提取精确称取桑叶粉末2.0000g, 经正交实验确定最佳提取条件为：用60%的乙醇, 超声波提取40min, 料液比为1: 30, 提取温度为503。2. 3 标准曲线的制作4精确称取芦丁标准品0.0053g, 用60%乙醇溶解,定容至50mL, 浓度为0.1075mg /mL。准确移取标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 置于10m l容量瓶中, 分别加入5% NANO2 溶液0.3mL 摇匀, 放置6min, 再加入10% Al( NO 3)3 溶液0.3mL 摇
14、匀, 放置6min, 加1mol/L NaOH 溶液4mL，用60%乙醇定容, 放置15min。在510nm 处测定吸光度, 以溶液浓度C为横坐标 , 吸光度A为纵坐标, 得回归方程为: C=0.2028A+ 0.0025, R2 = 0.9828。2. 4 样品的测定准确移取样品5mL两份置10mL容量瓶中, 一份用60%乙醇定容, 一份按标准溶液测定操作, 在510nm 处测定吸光度, 得A1、A2, 则样品吸光度为A = A2 - A1。按标准曲线计算桑叶中的总黄酮含量。根据正交实验结果, 用60%乙醇, 以料液比1: 30,温度 50e , 用超声波提取40m in。测得桑叶中的黄酮类
15、化合物的浸出率可达4. 13%。茶叶总黄酮含量的测定方法亚硝酸钠-硝酸铝法:精密称取105下干燥恒重的芦丁纯品0.1000 g，用50%的乙醇溶解，摇匀，定容至100 mL，再取10 mL此标准液于100 mL容量瓶中，稀释、定容为0.1 g/L的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。分别吸取上述芦丁标准液0. 00，0. 25，0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0 mL于10 mL比色管中，用50%乙醇稀释至5.00 mL，分别加入5% ( g/L)NaNO2 试液0.3 mL，摇匀，静置6 min。再加5%( g/L)Al (NO3 ) 3 试液0.3 mL，摇匀，静置6
16、min，再加4% NaOH 4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置12-15 min。于504-510nm处测试，以吸光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的质量(mg)为横坐标，用最小二乘法进行回归，线性方程: Y = 4. 071 10- 2 + 0. 1159X，相关系数r = 0. 9992。样品处理:茶叶:碧螺春、铁观音建。准确称取1. 0000 g干燥并研碎的茶叶于锥形瓶中，按170的固液比，加入50% 乙醇溶液，80水浴提取5 h。抽滤，茶汤转移到100 mL的容量瓶中， 50% 乙醇溶液定容。分别按上述标准曲线的实验步骤进行测定。食品中粗纤维的测定方法 GB 5009.
17、10-85 Method for determination of crude fiber in foods本标准适用于植物类食品中粗纤维含量的测定。1 原理：在硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用碱处理， 除去蛋白质及脂肪酸，遗留的残渣为粗纤维。如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后除去。2 试剂 2.1 1.25硫酸。 2.2 1.25氢氧化钾溶液。2.3 石棉：加 5氢氧化钠溶液浸泡石棉，在水浴上回流 8h 以上，再用热水充分洗涤。然后用 20盐酸在沸水浴上回流 8h 以上,再用热水充分洗涤,干燥。在 600700中灼烧 后，加水使成混悬物，贮存于玻塞瓶中。3
18、操作方法 3.1 称取 2030g 捣碎的样品（或 5.0g 干样品） ，移入 500mL 锥形瓶中，加入 200mL 煮沸 的 1.25硫酸，加热使微沸，保持体积恒定，维持 30min，每隔 5min 摇动锥形瓶一次，以充分混合瓶内的物质。3.2 取下锥形瓶，立即用亚麻布过滤后，用沸水洗涤至洗液不呈酸性。 3.3 再用 200mL 煮沸的 1.25氢氧化钾溶液，将亚麻布上的存留物洗入原锥形瓶内加热微沸 30min 后，取下锥形瓶，立即以亚麻布过滤，以沸水洗涤 23 次后，移入已干燥称量的 G2 垂融坩埚或同型号的垂融漏斗中，抽滤，用热水充分洗涤后，抽干。再依次用乙醇和乙醚洗涤一次。将坩埚和内
19、容物在 105烘箱中烘干后称量，重复操作,直至恒量。如样品中含有较多的不溶性杂质，则可将样品移入石棉坩埚，烘干称量后，再移入550高温炉中灰化，使含碳的物质全部灰化，置于干燥器内，冷却至室温称量,所损失的量即为粗纤维量。 3.4 计算 G X = 100 m 式中: X-样品中含粗纤维的含量，； G-残余物的质量（或经高温炉损失的质量） ，g; m-样品的质量， g。 附加说明：本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。 本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。 桑叶各化学成分的提取1 总生物碱的提取取桑叶380 g, 以蒸馏水煮沸提取3 次(
20、李向荣等, 2003) , 合并提取液, 进行离子交换, 用0. 5 mol/ L氨水溶液洗脱( 在洗脱液pH 9 时开始收集) , 洗脱液减压浓缩, 用正丁醇800 mL 萃取洗脱液, 萃取3次。合并萃取液, 减压浓缩, 挥干溶剂。得黑色粉末A 2. 30 g。用重量法( 肖崇厚, 2006) 测其含量, 桑叶总生物碱平均含量为27. 1% 。2 总多糖的提取取桑叶50 g 用沸水1 000 mL 提取3 次, 经过D-101 大孔吸附树脂, 柱流液减压浓缩, 用95%的乙醇静置沉淀, 得粗总多糖( 欧阳臻等, 2003) 。用Sevag 法脱蛋白: 将粗总多糖溶于100 mL 水中, 用活
21、性炭脱色, 过滤, 收集滤液置于分液漏斗, 加入氯仿B 正丁醇( 4 B 1) 400 mL, 分离弃去有机层及交界处的凝胶变性物质。重复直到水相部分与茚三酮反应为阴性。将水相部分浓缩, 用95% 乙醇静置沉淀, 沉淀先乙醇后丙酮, 反复淋洗至淋洗液无色, 减压干燥( 60 e ) , 得精制桑叶总多糖B 1. 52 g ( 白色无定形粉末) 。用硫酸一蒽酮比色法测定, 桑叶精制多糖B 的含量为61. 8%。3 总黄酮苷的提取取桑叶1. 5 kg, 沸水15 L 煮3 次, 每次1 h, 合并提取液过滤, 滤液用D-101 大孔吸附树脂吸附( 80mm 800 mm, 流速10 mL/ min) , 至树脂吸附饱和;先用蒸馏水洗涤至无色, 再用80%乙醇洗脱。洗脱液减压浓缩, 干燥得桑叶粗黄酮( 唐孟成等, 1996) 。粗黄酮用无水乙醇回流提取3 次, 第一次1 h, 第二、三次各0. 5 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压干燥得精制黄酮C 43 g 。经HPLC 外标法定量, 计算标样中总黄酮含量为27. 3%。
