1、Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、 组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP 管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：用研磨棒将装有冻存组织的 EP 管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的 EP 管中。装有组织粉末的 EP 管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80保存。注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤 180至少 3h以上。2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。3
2、.每种样品都最好留有副管，备用。二、 裂解提蛋白准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为 1:1000（即 1ml 裂解液加 1l 蛋白酶抑制剂）步骤：将 RIPA 和 PMSF 按比例混匀，加入到装有组织粉末的 EP 管中，一般加入300500l 左右（浓度尽量高点） 。盖好盖子，在冰上裂解 3040min.到时间后于 4，12000rpm 离心 10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20保存。注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。三、 BCA 法测定蛋白浓度（ BCA 试
3、剂盒）准备：BCA 试剂盒（BCA 试剂 A、BCA 试剂 B、蛋白标准液） 、酶标板、酶标仪、摇床步骤：按 1:15 或 1:30 稀释待测样品，即取 1l 样品+14l 水。按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。孔号 0 1 2 3 4 5 6蛋白标准液（l）0 1 2 4 6 8 10去离子水（l） 10 9 8 6 4 2 0蛋白含量（g）0 1 2 4 6 8 10按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1 ）根据样品数量配制BCA 工作液。每个标准品孔加入 200l BCA 工作液，样品孔加入待测样品 10l 和 200l BCA 工作液，充分混匀
4、，在摇床上震荡 30s，37放置 30min，于 492nm 下测定 OD值。标准曲线以蛋白含量（g）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）稀释倍数g/l3.保证样品液中的蛋白含量相同（500g/100 l ） ,则取 10l 样品液中含有50g 蛋白。4.样品液稀释液要再沸水浴中煮 10min（可用微波炉加热） ，放凉至室温后于-20保存。四、 SDS-PAGE 蛋白质电泳(一)、配胶准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子步骤:选择适合电泳板（0.75mm:1.0m
5、m:1.5mm） ，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。首先配制分离胶（一般用 12%的 SDS-PAGE 分离胶） ，按分离胶配方配制，配胶时最后加 APS 和 TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约 1cm 处（绿色线处） ，不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约 30min 至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于 37烘箱中。配制浓缩胶（5%的 Arcymalide 浓缩胶） ，混匀，注意减少气泡产生。带分离胶聚合后，倒掉上
6、层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置 2030min 至凝胶聚合。注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。2.12%分离胶配方：不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分 5 10 15 20 25 30H2O 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.930%Arcylamide 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.01.0M Tris-HCL(PH8.8)1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.20 0.25 0.3010%APS 0.05 0.1 0
7、.15 0.20 0.25 0.30TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.0123.SDS-PAGE 浓缩胶配方（5%Arcylamide）不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分 2 3 4 5 6 8H2O 0.68 1.4 2.7 3.4 4.1 5.530%Arcylamide 0.17 0.33 0.67 0.83 1.0 1.31.0M Tris-HCL(PH8.8)0.13 0.25 0.5 0.63 0.75 1.010%SDS 0.01 0.02 0.04 0.05 0.06 0.0810%APS 0.01 0.02 0.04
8、 0.05 0.06 0.08TEMED 0.001 0.002 0.004 0.005 0.006 0.0084.配胶时加入的 APS 和 TEMED 是助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。(二)、电泳准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品、marker步骤：取 1电泳缓冲液，待浓缩胶聚合完全后，将胶架放入电泳槽内，将电泳缓冲液倒满内槽，内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出灌满外槽，内槽电泳液低于外槽，拔出梳子，向梳子孔内加样。加样量为每孔 8l 或 10l，如有剩余的孔，可加入等体积的 1loading buffer 上样缓冲液，以防止样品胶跑歪。marker 一般点在
9、最左侧。将电泳槽与电泳仪连接，打开电泳仪开关，恒压 80V 预电泳 10min 至溴酚蓝前沿到达分离胶，将电压调整到恒压 120V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，注意不要让溴酚蓝跑出分离胶。注意：1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区分，分子量大的蛋白跑的慢，在上端。2.电泳液可回收多利用几次，一周左右。（三） 、转膜准备：甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、海绵、PVDF 膜或 NC 膜步骤：电泳结束后立即转膜防止蛋白分散，剪取一张与凝胶大小相仿的 PVDF 膜，2 块海绵，6 张滤纸。将 PVDF 膜用甲醇活化约 3min，然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓冲液的托盘中平衡 15min。取下
10、凝胶用切片切取需要的部分，两端以 marker 和上样边缘为界，用转膜缓冲液冲洗凝胶几次，在湿转板黑色面放置一张海绵、三张滤纸，再放置凝胶，每一层都要用玻璃棒赶出气泡。从甲醇中取出活化的膜在转膜缓冲液中浸洗一下，放在胶上，正面朝凝胶，再放三张滤纸、一张海绵，每一层用玻璃棒赶出气泡，最后夹紧转移夹。转移夹正极板（白色）对着电泳槽红色面，放入电泳槽中通电转膜，恒压72V 或恒流 300mA。注意：1.20KD 以上的蛋白转膜时间约 1h 以上，100KD 的蛋白转膜时间约 1.5h 左右，10KD 左右的蛋白转膜时间为 2030min 左右。2.转膜要在冰水浴中进行，避免体系温度过高。3.操作时要
11、戴手套，用镊子夹持 PVDF 膜边缘防止划伤膜或染上杂蛋白。4.PVDF 膜可多次曝光（8 次左右） ，NC 膜可曝光 23 次。（四） 、封闭准备：脱脂奶粉、TBST 缓冲液步骤：转膜结束后，小心取出凝胶和膜，可在膜上观察到预染 marker 的条带。配制 5%的脱脂奶粉（5g 脱脂奶粉+100mlTBST 缓冲液）封闭液，将膜放入盛有封闭液的容器中，室温摇床封闭 1h。注意：1.可用考马斯亮蓝将凝胶染色以判断转移情况。2.NC 膜可置于丽春红染色液中，室温下染色 5min，用双蒸水洗膜至水变清，无色蛋白条带清晰，说明染色效果好。（五） 、一抗孵育准备：抗体、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机步骤
12、：根据抗体说明书以适当比例用 5%脱脂奶粉稀释一抗。将自封袋剪去封口条，两边剪开，封闭后的 PVDF 膜小心放入袋内，通常 4 号袋可放置 34 条膜，膜与膜之间用封口机封好，剪开。加入配好的一抗溶液，小心排除气泡，用封口机封口后正面朝上（与凝胶接触的一面）在摇床上 4过夜孵育或室温孵育 13h。孵育后将膜取出，一抗溶液可回收放置-20保存两周回收利用。用 TBST 在摇床上洗膜 3 次，每次 5min 以去除残留的一抗。（六） 、二抗孵育准备：二抗、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机步骤：用 5%脱脂奶粉按二抗说明书以适当比例稀释（1:40001:20000） 。按一抗孵育的操作给洗过的膜孵育二抗
13、。室温摇床孵育 2h，孵育后将膜取出，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5min 除去残留的二抗。五、 曝光鉴定准备：显影液、定影液、自来水、发光液 A、发光液 B步骤：在暗室中将定影液、显影液、自来水分别倒入塑料盘中备用。于一离心管中加入发光液 A、发光液 B 各 200l，混匀。在暗盒内放置一层自封袋，底层可用双面胶粘好，擦净后将漂洗后的膜正面朝上，摆放在塑料膜上，将发光液均匀的滴在 PVDF 膜上，用另一层塑料膜盖好膜，小心排除气泡。在暗室中取出一张 X 光胶皮，用剪刀剪成适当大小，根据肉眼观察到的荧光强弱调整曝光时间，胶片一旦放上不可移动。通过多次曝光以到达最佳效果。曝光完成后打开暗盒
14、取出 X 光胶片，浸入显影液中不停摇动显影，在红光下观察出现明显条带（一般约 1min） ，立即浸入定影液中（一般约 510min） ，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液，室温下晾干，胶片保存在干燥阴凉处。注意：1.若肉眼即可观察到可见荧光，则只需压片 12s，一般压片时间为 510min。2.显影、定影和冲洗可在显影仪中一步进行。六、扫描及分析准备：数码相机、Photoshop、Quantity one 软件步骤：选取效果较好的胶片拍照，导入计算机。用 Photoshop 简单处理图片，转成灰度模式，保存为.tif 格式。用 Quantity one 软件分析条带的光密度值（灰度值） 。Quantity one 软件的使用：(1)选取要分析的条带框住，复制粘贴至数目比样品数多1（留有一个框空白背景） ，方框大小不可改变。(2)分析光密度值，将结果导入到 Excel 表中，计算目的蛋白与内参蛋白的光密度比值，制成柱形图。
