1、医学分子生物学 Medical Molecular Biology,Chapter 基因诊断Gene Diagnosis,基因诊断概念（gene diagnosis)通过对基因或基因组进行直接分析而诊断疾病的方法。（DNA或RNA水平）基因诊断建立在分子生物学技术发展的基础上：20世纪70年代，核酸分子杂交技术。20世纪80年代，PCR技术20世纪90年代，基因芯片(gene chip),1 为什么需要建立基因诊断方法？,目前常用的诊断方法有一定局限性。物理诊断：望、叩、触、听等，生化、免疫学、病理学、影像学检查等。 共同特点：针对疾病的表型改变建立诊断指标。对于多数非感染性疾病而言，引起疾病
2、发生的根本原因是基因结构或表达异常；感染性疾病的发生则是由于病原体侵入体内，表达外源基因所致。,基因及基因表达异常将导致疾病,疾病,几乎所有的疾病都与基因改变有关,基因诊断不仅可以在表型改变前进行早期诊断，更是对疾病进行本质进行诊断。基因诊断结果还能提示疾病发生机制。,2 基因诊断的特点,直接以病理基因（致病基因、疾病基因和外源性病源生物基因）为分析对象。可确定病源生物基因是否存在，或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变。以DNA 或 RNA为材料，是分子水平上的诊断。特异性强，灵敏度高。,逆向诊断（reverse diagnosis）: 和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型，即可
3、以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断，这样就改变了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为逆向诊断（reverse diagnosis） 。有预测作用： 可揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测。对有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。,3 目前临床上基因诊断用于哪些疾病？,遗传病异常血红蛋白病、地贫、地贫杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD)笨丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)脆性X综合征,肿瘤,白血病的诊断和分型（利用融合基因）鼻咽癌
4、、 Burkitt淋巴瘤（检测EB病毒）子宫颈癌 （检测 人类乳头瘤病毒 HPV)肝癌 （检测乙型肝炎病毒 HBV)( 检测丙型肝炎病毒 HCV)成人T细胞性白血病淋巴瘤 HTLV-1 病毒,感染性疾病,病毒感染性疾病： 乙型肝炎（HBV)； 严重急性呼吸综合征（SARS）细菌感染性疾病： 细菌性痢疾（痢疾杆菌、大肠杆菌） 结核病（结核分枝杆菌）寄生虫感染性疾病：如疟原虫感染,基因诊断的样本,获取便利，一般不受组织或时相限制，包括： 外周血白细胞、口腔粘膜细胞 活检标本、发根 、石腊包埋的组织块 沉淀细胞（唾液、痰液、尿液） 羊水细胞、绒毛细胞、胚胎植入前细胞进入母体循环的胎儿细胞 应用PCR
5、，样本可微量化到一个细胞,二、基因诊断方法,（一）基因诊断的常用技术,1.核酸分子杂交技术：用于检测样品中是否存在相应的基因或相应基因的表达状态。（1）Southern杂交：用于分析基因组中特定基因的结构和定量 （2）Northern杂交：检测mRNA的表达水平和长度分析 （3） 斑点杂交：用于检测细胞中基因拷贝数的变化或mRNA含量变化。简便，易出现假阳性。 （4） 原位杂交：用于组织和细胞内DNA或RNA定性或精确定位分析,（5）等位基因特异性寡核苷酸杂交法（ASOH) ：根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检者的DNA杂交，根据样品与
6、两种探针结合信号的强弱，可检测出：被检者是否存在基因突变以及被检者是该突变基因的纯合子或杂合子,异常探针T A G,正常人 患者DNA DNA,点杂交,正常探针G A G,正常人 患者DNA DNA,点杂交,纯合突变,正常 C T C,异常 C T A,点突变基因,2. 限制性内切酶片段长度多态性,*由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP*RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。,Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP,RFLP 进
7、行基因诊断的基本步骤,Allele II 产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,Allele II 酶切位点消失,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,3. 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction ， PCR),PCR技术优点特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。PCR缺点由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,该技术已成为基因诊断的主要
8、和首选技术。,PCR相关技术,名称 用途 SSPPCR 等位基因分型和突变分析 RT-PCR 转录水平的基因表达、基因检测与基因克隆 多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物扩增同一模板的几个区域 PCR-ASO 等位基因分型和突变基因分型 PCR-RFLP 等位基因分型和突变点分析 PCR-SSCP 常用筛查基因突变方法 PCR-DGGE 常用筛查突变基因方法,4.单链构象多态性(SSCP) 检测,单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异。碱基微小差异DNA构象差异电泳迁移率差异灵
9、敏检出突变。,PCR产物变性后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。,5. DNA序列测定 6. DNA芯片技术基因芯片,又称DNA微阵列(DNA microarray），就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地（点与点间距一般小于500um）排列在玻璃、硅等载体上，制成基因微矩阵（Microarray）。,基因诊断技术应用存在的问题,理论问题： 理论依据还有限目前真正弄清楚了发生发展分子机制的疾病很少。已经找到的疾病基因或致病基因还不多。发展方向应是：应用现有的DNA分析技术，不断扩大可进行分子诊断的疾病种类；更重要的是加强对疾病发生分子基础的研究。为更
10、多疾病的基因诊断提供理论依据。,技术问题：对设备及条件要求高、所需试剂价格昂贵、对操作人员要求高。诊断技术复杂精细，技术灵敏度高，如操作不当或受污染，易出现假阳性。伦理问题：可能引起基因歧视；胎儿的出生权争论等,三、基因诊断实例,血红蛋白病珠蛋白的基因诊断,（一）遗传病的基因诊断,血红蛋白病：由于遗传上的缺陷，珠蛋白基因异常导致的血红蛋白结构变异，或者造成珠蛋白链的合成减少。,地中海贫血：血红蛋白结构正常，但一种（偶尔几种）珠蛋白链的合成量减少或缺乏,异常血红蛋白病：血红蛋白结构异常造成的疾病,地中海贫血 地中海贫血,血红蛋白(Hb)的结构,分子组成：血红素 珠蛋白（Heme) (globin
11、)一条肽链 一分子血红素 Hb单体个Hb单体 球形四聚体,血红蛋白结构示意图,和珠蛋白基因的结构,：胚胎期表达，：假基因，：胎儿和成人期表达,地中海贫血：基因缺失导致珠蛋白mRNA含量减少。基因缺失（PCR法）， 珠蛋白mRNA含量减少（RT-PCR法）。, 珠蛋白基因簇- 11号染色体短臂, 7个基因 , 66 kb,：胚胎早期表达 ：胚胎期、胎儿期表达 、：成人期表达， 表达量少（2.5%）表达量多（92%）,地中海贫血：基因点突变导致珠蛋白mRNA含量减少。常染色体共显性遗传，纯合子为重型地中海贫血，杂合子为轻型。 PCR/ASOH是目前基因诊断地中海贫血的最主要途径,异常血红蛋白病 (
12、Hb病),常见的遗传病1.5亿为Hb病基因携带者(1982年)30余万/年，Hb病新生儿降生,珠蛋白基因异常，产生结构变异的Hb，造成的疾病。 纯合子轻度贫血，杂合子不贫血。,已知突变基因编码珠蛋白链的第6位密码子GAGGTG谷氨酸缬氨酸,镰形红细胞性贫血（sickle-cell anemia）的Gene诊断,Mst： CCTNAGG,镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子,A： CCTGAGGAG S： CCTGTGGAG,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,S：,A,等位基因特异性寡核苷酸杂交 (ASO)探针诊断,已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探
13、针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。Normal Gene Probe与正常 杂交Mutation S Gene Probe与异常 S杂交,异常探针T A G,正常人 患者DNA DNA,点杂交,正常探针G A G,正常人 患者DNA DNA,点杂交,纯合突变,二、感染性疾病的分子诊断,定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。动态、定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据。采用核酸分子杂交或PCR技术,（三）肿瘤的基因诊断,肿瘤是由于肿瘤相关基因发生突变而导致的疾病。,肿瘤相关基因的突变只是增加了个体对肿瘤的易感性，而并
14、不一定马上产生肿瘤。,肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程。,癌基因的结构和表达异常，及抑癌基因的突变、丢失是肿瘤发生的重要原因。,肺癌诊断实例,癌基因（ras、myc、erb和src家族）的扩增、突变及过表达， 抑癌基因（Rb、p53）的缺失、突变。,检测ras基因突变，p53突变或缺失 （PCR/ASOH或PCR/SSCP/DNA序列测定）,ras、myc、erb和src癌基因的过表达 （Northern blot）,四、基因诊断在法医学上的应用,这孩子一点也不像我，是不是要去做做亲子鉴定？,亲子鉴定,个体识别：,将现场检材和嫌疑犯的DNA指纹进行对比。若条带 的数量、位置和强度完全一致，即可视为同一个体。 若有差异，还要计算同一性认定的可信度。,结束语,基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断。目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术的不断发展,基因诊断技术将会更加广泛。,
