1、柴胡有效成分提取工艺的研究作者:作者：肖功胜，杨云，孙维英，冯云霞，朱振华 作者单位：河南中医学院药学院，河南 郑州 450008 来源：医学期刊 / 中国医学收藏本文章【摘要】 目的确定柴胡有效成分提取的最佳工艺。方法以柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷 a 的含量为指标，采用单因素实验筛选主要因素和水平，再以正交实验筛选柴胡有效成分提取最佳工艺。结果最佳工艺参数为 40温浸，收集相当于药材 2 倍量蒸馏液，继用 8 倍量含 5%氨水的 95%乙醇回流 1 h 提取柴胡皂苷，可使挥发油吸收度达 0.941，柴胡皂苷 a 的含量达 0.32%。结论该工艺为柴胡有效成分的提取提供了可靠依据，且工艺条件
2、稳定可靠，重复性好。 【关键词】 提取工艺 柴胡皂苷 a 挥发油 正交实验Study on Extraction Technology of Active Ingredients from Bupleurum chinense DCXIAO Gong-sheng，YANG Yun*，SUN Wei-ying,FENG Yun-xia，ZHU Zhen-hua College of Pharmacology, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, ChinaAbstract：ObjectiveTo
3、determine the optimum technology of active ingredients from Bupleurum chinense DC.MethodsWith the absorbance of volatile oils and the content of saikosaponin a in Bupleurum chinense DC as indexes, the major influencing factors and levels were observed by single factor experiment, and the optimum tec
4、hnology was optimized by orthogonal experiment. ResultsThe optimum condition was as follows: the impregnating temperature was 40 ,the volume of distilled fluid was 2 times of weight of Bupleurum chinense DC, and the volume of 95%alcohol with 5%ammonia water to reflux extraction for 1hour was 8 times
5、 of weight of Bupleurum chinense DC, then the absorbance of volatile oils was 0.941 and the content of saikosaponin a was 0.32%.ConclusionThe optimum technology provides reliable evidence for extraction of active ingredients from Bupuleurum chinense DC, and the conditions are accurate and reliable w
6、ith good reproducibility.Key words：Extraction technology; Saikosaponin a; Volatile oils; Orthogonal experiment柴胡为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Wild 的干燥根1。具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举陷之功效，为中医治疗少阳症的首选要药。其主要化学成分为柴胡皂苷和挥发油类。柴胡作为临床常用药，中成药制剂品种众多，且大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，而多以水蒸气蒸馏法提取挥发油2。由于柴胡皂苷 a
7、、d 化学结构均具不稳定性，遇酸或受热易分别降解生成活性较弱的次生苷 b1，b2，因此随着水蒸气蒸馏法提取时间的延长，柴胡皂苷 a，d 的含量将逐渐降低，以致严重影响了柴胡制剂的质量和临床疗效。目前国内关于柴胡提取工艺的文献报道较多，但多以挥发油或柴胡皂苷 a 单独为指标进行考察，很少有同时考察挥发油和柴胡皂苷 a 的文献报道，更是未曾有文献报道过在保证挥发油提取率的同时还兼顾柴胡皂苷 a 的充分提取。因此，本研究采用正交实验综合考察柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷 a 含量，筛选最佳工艺，以期为提高柴胡制剂的质量和疗效打下坚实基础。1 仪器与试药1.1 仪器岛津 LC-20A 高效液相分析仪（S
8、PD-20A 紫外检测器）；752 紫外分光光度计（上海精密仪器科技有限公司）；RE 52-86A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER AE240电子分析天平（瑞士）。1.2 试药柴胡药材购于河南省药材公司，经本院陈随清教授鉴定为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.的干燥根；柴胡皂苷 a 对照品自制，经峰面积归一化法测定含量为：99.91% ；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。2 方法2.1 单因素实验分别以药材浸渍温度、浸渍时间、料液体积比、蒸馏液收集量等为因素，在不同水平下进行单因素实验，筛选出影响柴胡挥发油提取的主要因素和水平，同样分
9、别以乙醇浓度、pH 值、柴胡皂苷提取时间、料液体积比等为因素，在不同水平下进行单因素实验，筛选出影响柴胡皂苷提取的主要因素和水平。从而为正交实验设计提供依据。2.2 挥发油的提取和测定方法随机称取 50 g 柴胡干燥粗粉，置于 500 ml 圆底烧瓶中，采用水蒸气蒸馏法在不同条件下提取柴胡挥发油，收集蒸馏液，加 3%丙二醇摇匀，精密量取上述蒸馏液 2 ml 两份，一份置 5 ml 容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，作为样品液，另一份置蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，转移至 5 ml 容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，作为空白。用 752 紫外分光光度计在 277 nm 波长处测定蒸馏液中挥发
10、油的吸收度。2.3 柴胡皂苷的提取取提取挥发油后的药渣，滤干，置于 500 ml 圆底烧瓶中，在不同条件下回流提取柴胡皂苷，过滤得滤液，减压低温浓缩成每毫升含 0.5 g 柴胡的浓缩液，备用。2.4 柴胡皂苷 a 含量测定2.4.1 色谱条件大连伊利特 C18(4.6 mm250 mm,5m)；流动相为乙腈-水 3763；流速 1 ml/min；检测波长 208 nm；柱温 35；进样量 20 l。2.4.2 对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷 a 对照品 5.09 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，配成 0.509 mg/ml 对照品溶液，冷藏备用。2.4.3 供试品溶液的制备取上述浓
11、缩液 10 ml 减压蒸干，加 20 ml 甲醇溶解残渣，过滤得滤液。再取 2 ml 滤液至 10 ml 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，冷藏备用。2.4.4 线性范围考察精密吸取对照品储备液 2.0，6.0，10.0，14.0，18.0 l，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，以峰面积积分值 Y 为纵坐标，对照品溶液进样量 X（l）为横坐标，进行线性回归（n=5）， 得线性回归方程为 Y=209 413.7X162 379.4，线性范围为 0.972 09.635g，相关系数为 r=0.999 7，线性关系良好。2.4.5 精密度实验精密吸取对照品 20 l，在“2.4.1”项下
12、色谱条件下重复进样 5 次测定，记录峰面积，RSD 为 1.5%（n=5），表明精密度良好。2.4.6 稳定性实验将供试品溶液在室温下贮存，在“2.4.1”项下色谱条件下，分别于 0，2，4，6，8h进样测定，记录峰面积，RSD 为 2.0%，表明样品在 8 h 内稳定。2.4.7 重复性实验 精密称取同一批样品 5 份，按供试品溶液处理方法制备样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样测定 5 次，记录峰面积，RSD 为 2.1%（n=5）。2.4.8 样品测定精密吸取 20 l 样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算各样品中柴胡皂苷 a 的含量。2.5 正
13、交实验以柴胡蒸馏液中挥发油的吸收度和柴胡皂苷 a 的含量为检测指标，参照单因素实验结果，分别以药材浸渍温度、挥发油收集量、柴胡皂苷提取时间、柴胡皂苷提取溶剂料液比等主要因素及不同水平进行 L9(34)正交设计，筛选最佳工艺。正交实验因素和水平见表 1。表 1 正交实验因素及水平（略）3 结果3.1 浸渍温度对挥发油提取效果的影响分别在 30，40，60，80温度下浸渍 6 h，料液比 16，提取 1 次，考察浸渍温度对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.303，0.984，0.758，0.587。由测定结果可知，在 40下浸渍吸收度达到最大。且变化显著，所以浸渍温度应选在 40左右。3
14、.2 浸渍时间对挥发油提取效果的影响在 40下，分别浸渍 0，2，4，6，8 h，料液比 16，提取 1 次，考察浸渍时间对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.470，0.559，0.650，0.940，0.722。由测定结果可知，浸渍 6h 吸收度最大，浸渍 4h和 8h 吸收度相当。3.3 料液比对挥发油提取效果的影响料液比分别为 15，16，18，110，提取1 次，考察料液比对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.316，0.443，0.337，0.258。由测定结果可见，料液比 16 吸收度最大。且变化显著。3.4 挥发油收集量对挥发油提取效果的影响分别收集 100，2
15、00，300 ml 蒸馏液，考察挥发油收集量对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.454，0.507，0.596。由测定结果可知。随着收集量的增多，吸收度逐渐增大，但增加趋势不显著。3.5 乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响分别以 95%，75%，60%，45%乙醇，料液比为：16，提取柴胡皂苷。考察不同乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷 a 含量依次为：0.20%，0.15%，0.12%，0.12%。由测定结果可知，柴胡皂苷提取率随乙醇浓度的降低而降低。在 95 %乙醇浓度时最大。且变化较显著。因此选用 95 %乙醇提取。3.6 pH 值对柴胡皂苷提取效果的影响分别用 0，5%
16、，10%，15%的氨水 95%乙醇液提取皂苷。考察 pH 值对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷 a 含量依次为：0.20%，0.25%，0.24%，0.24%。由测定结果可知，碱性乙醇提取效果比较好，含 5%10%氨水 95%乙醇条件下提取液中柴胡皂苷 a 变化不显著，因此选用含 5%氨水。3.7 提取时间对柴胡皂苷提取效果的影响用 95 %乙醇分别在 0.5，1，2，3h 提取皂苷。考察提取时间对皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷 a 含量依次为：0.20%，0.25%，0.20%，0.20%。由测定结果可知，提取 1h 时提取率最大。提取时间再长提取率就逐渐下降。3.8 料液比对柴胡皂苷提取效果
17、的影响在 10，8，6，5，3 倍不同料液比条件下回流提取柴胡皂苷。考察料液比对柴胡皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷 a 含量依次为：0.15%，0.15%，0.20%，0.21%，0.14%。由测定结果可知，料液比为在 56 倍时提取率最大。3.9 正交实验结果与分析因柴胡中的挥发油和柴胡皂苷 a 均为有效成分，权重应相等。则规定吸收度中最大值 0.945 及柴胡皂苷 a 含量中最大值 0.33%为 100，其余值对应比较，两项加和后平均得综合评分值。结果见表 2，方差分析见表 3。表 2 正交实验结果与分析（略）表 3 误差分析（略）由表 2 和表 3 可知，柴胡挥发油收集量的极差最大，其次是
18、料液比和柴胡皂苷提取时间，故对于柴胡提取效果影响的大小顺序为 BDCA，由于 A 和 C 影响不显著，故综合考虑，选择最佳提取方案为 A1B1C1D3，即 40浸渍，收集 100 ml 挥发油，8 倍量含 5 % 氨水的 95 %乙醇提取 1 h。3.10 最佳方案的验证实验取 50g 柴胡粗粉置 500ml 圆底烧瓶中，在最佳提取条件下提取。重复两次。结果见表 4。表 4 验证实验结果（略）由表 4 可见，采用优化最佳工艺提取有效成分柴胡挥发油和皂苷，其挥发油吸收度和柴胡皂苷 a 的含量都较高，且工艺条件稳定可靠，重复性好。4 讨论柴胡挥发油和柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分，两者的提取是较为矛
19、盾的。据文献资料，柴胡皂苷在 6 h 内稳定，而要完全提取挥发油则要较长时间。这将导致柴胡皂苷的分解、降解等一系列不稳定的反应，使柴胡皂苷的含量降低。因此要同时兼顾挥发油和柴胡皂苷的提取，可考虑采用水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油，采用碱性醇提工艺代替传统的水提工艺提取柴胡皂苷。且在提取过程中发现，柴胡皂苷 a 受热容易分解，随着加热时间增长，含量逐渐减少，因此在各加热环节，如提取，浓缩，干燥过程中应尽量采用低温，以减少柴胡皂苷 a 的损失。中药成分复杂,应综合考虑各有效成分的性质及其在制备过程中的变化,以保证制剂的质量和疗效。据文献资料，柴胡中含柴胡皂苷 a 大约在 0.2 %0.4 %，从本实验最佳工艺提取液中测得柴胡中柴胡皂苷 a 的含量为 0.32 %，因此本工艺提取效果较好。至于挥发油的含量，各种文献所得结果不尽相同，甚至相差 10 倍以上，由于药材的原因，如药材部位、采收时间、产地等的影响难以衡量，因此本实验在不影响挥发油提取的前提下还兼顾了柴胡皂苷 a 的提取，从而为柴胡的提取提供可靠的依据和参照。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典，部S.北京:化学工业出版社，2005：562.2杨云.天然药物化学成分提取分离手册（修订版）M.北京:中国中医药出版社,2002:612.
