1、实验四：细菌的分离、接种和培养 一、实验目的：熟悉从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，掌握以下几种细菌纯培养过程中所涉及的各种技能：（1） 倒平板；（2） 细菌纯种分离：稀释平板分离法和平板划线法；（3） 接种技术：斜面接种技术、稀释平板涂布法等；（4） 无菌操作技术。并了解不同的微生物在固体培养基中的生长特征。二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养。一般是
2、根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。三、实验试剂与器材1. 牛肉膏蛋白胨培养基；2. 试管、三角烧瓶、培养皿；3. 接种环，土样，酒精灯等。四、操作步骤1. 每组配牛肉膏蛋白胨培养基 250 mL，放在三角瓶中，加热溶解后取 23 mL 加至试管中，每人做一支试管。其配方如下: 牛肉膏 3 g、蛋白胨 l0g、NaCl 5 g、琼脂1520 g、水 1000 mL、pH 7.47.6
3、2. 每组包 10 个培养皿，待灭菌。3. 将试管、空的培养皿、剩余的培养基以及 10 mL 蒸馏水放入高压灭菌锅灭菌于 121 oC下 20 min。4. 倒平板：在无菌操作台上，将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。5. 在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径 2-3 厘米的位置。6. 待培养皿和试管中的培养基冷却凝固后，点燃酒精灯。7. 接种。 取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样) 、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。取菌种：待环冷却后轻轻
4、沾取经稀释 10 倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：(1) 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3-4 条，再转动培养皿约 70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图 A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于 37温室中培养。(2) 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线( 图 B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。环灭菌 将接种环烧红灭菌。5. 培养 1 周后观察。四、注意事项:实验操作过程中无菌操作。五、思考题1. 简述无菌操作过程中的注意点。
