1、转基因微生物应用调研报告摘要：本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状，以及不同用途的转基因微生物环境释放可能产生的安全性问题及生物安全控制策略。摘要：转基因 微生物 应用1转基因微生物在食品生产领域的应用11转基因微生物生产食品用酶制剂直接用作食品的转基因微生物如发酵食品菌等目前在市场上尚未出现。在国外，将转101基因细菌和真菌生产的酶用于食品生产和加工已经比较普遍，如奶酪生产中使用的凝乳酶、啤酒和饮料生产中的淀粉酶，以及面包等食品生产中的蛋白酶等。在食品工业中，微生物可用于生产酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、色素、香料等添加剂。氨基酸、
2、有机酸、维生素、色素和香料等生产菌种的改良涉及到的基因较多，调控复杂，不易利用基因工程技术进行改良，大多仍处于研究阶段，只有少数氨基酸和维生素以转基因微生物生产。而酶制剂应用广泛，涉及的基因单一，适合利用基因工程技术进行改良(王家勤1999)。目前工业上着重于对乳酸菌和酵母菌的基因工程改良。利用基因工程技术改良菌种生产的第一种食品酶制剂是凝乳酶，始于1998年。这一技术已得到了广泛的应用，到2001年，已有17个国家使用转基因微生物的凝乳酶生产干酪。据估计，美国有2，3到34的奶酪在生产过程中使用了遗传工程凝乳酶(刘谦等2001)。目前被批准使用的转基因微生物凝乳酶产品有3种，其基因表现的宿主
3、分别为 Aniger，K L-fis 以及 Ecoil K12。(朱文深2001)。在全球范围内，很多企业已成功地应用转基因微生物生产食品酶制剂，如丹麦的 Novo-Nordisk 公司和荷兰的 GistBrocades 公司。生产食品酶制剂的转基因微生物包括浅青紫链霉菌、锈赤链霉菌、枯草芽孢菌、地衣芽孢杆菌、特氏克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等(陈红兵等2001)。1.2转基因酵母在啤酒葡萄酒生产上的应用转基因酵母菌在食品生产上的应用也较为多见，目前已获准商业化使用的转基因酵母菌有面包酵母和啤酒酵母。利用转基因啤酒酵母所生产的啤酒已被消费者试用，但尚未在市场上得以推广。转基因方法
4、还用于葡萄酒酵母工程菌的育种，已对苹果酸乳酸发酵基因及其调节基因进行了定位和序列分析，试图把乳酸菌中的苹果酸一乳酸发酵酶基因通过遗传转化导入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精发酵的同时，赋予其苹果酸乳酸发酵降酸的功能(张春晖等2000)。2.转基因微生物在农业生产领域的应用目前，中国是世界上农业重组微生物环境释放面积最大、种类最多和研究范围最广的国家。1997-1999年，经农业部农业生物基因工程安全委员会批准的转基因微生物的中间试验有29项，其中22项为植物用转基因微生物，7项为兽用转基因微生物：同期经批准的转基因微生物的环境释放有7项，其中6项为植物用转基因微生物，1项为兽用转基因微生物(樊
5、龙江等2001)。 2.1转基因微生物农药1980年代中期以来，国内外在防病杀虫转基因微生物的研究方面取得了一系列突破性进展，转基因微生物制品领先于转基因植物进入商业化应用，其中重要的有防治虫害的 Bt 高效工程菌剂、转基因病毒制剂、防治植物霜冻的无冰核活性工程菌、防治果树根癌病的放射土壤杆菌工程菌 K1026等(朱守一1999)。中国的转基因微生物农药主要以苏云金芽孢杆菌(Bt)基因工程制剂和转基因病毒制102剂为主，一批拥有自主知识产权的重组微生物农药产品已初具产业规模，转 Bt 基因重组杆状病毒、高毒广谱杀虫工程菌、棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂等多种基因工程微生物杀虫剂经农业部安全性审批获
6、准进入田间释放或中间试验。(1)转基因 Bt 菌剂。苏云金杆菌(简称 Bt)杀虫剂是公认的一类无公害的生物农药，是目前国内外生产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。自1981年 Schnepf 分离了第一个 cry 基因以来，全世界从 Bt 中发现并正式命名的 ICP 基因已有42大类，总数超过250种(黄大畴2003)。国外已有 CoMer、MVP 等10余种 Bt 工程菌制剂投入商业化应用。美国Ecogen、Novartis、Mycogen 和 Research Seed 等公司生产的转 Bt 遗传工程菌己通过美国环保局和农业部的批准进入商业化生产。美国 Mycogen 公司将苏云金芽孢杆
7、菌的杀虫蛋白基因导入荧光假单孢菌，并在其发酵生成晶体蛋白后将菌体细胞灭活，用这种“生物微囊”技术加工的菌剂对紫外线的抵抗力可提高36倍，自1991年起已有 MVP、MTrak 及MPeril 等多个产品获准登记，用于防治小菜蛾等蔬菜害虫、马铃薯甲虫和玉米螟等。美国作物遗传国际公司(Crop Genetics Intemational)将 Bt 基因导入能在玉米植株维管束内繁殖的内生菌中，杀虫毒素可随细菌的繁殖而不断增殖，从而显著降低玉米螟的侵害率。此外，拓宽杀虫范围、加快杀虫速度的转基因病毒制剂也于1990年代初期进入大规模环境释放阶段(刘谦等2001)。1997年以来，中国自行克隆并经国际命
8、名的新的杀虫蛋白基因达28种，占国际同期新发现Bt 基因总数的13(黄大防2003)，防治小麦全蚀病工程菌荧光93、防治水稻白叶枯病工程菌 Du728和 SL3751、转不同特异 Bt 杀虫晶体蛋白基因和增效基因以延缓害虫抗性产生的高效广谱工程菌 BMB820Bt、转 Bt 杀虫晶体蛋白基因并兼有杀虫与防病作用的重组荧光假单孢菌和枯草芽孢杆菌等己进入中间试验或环境释放阶段，高产广谱工程菌 WG001已于2000年通过批准进入商业化生产(刘谦等2001)。华中农业大学研制的苏云金芽孢杆菌高毒力菌株 YBT-1520获得国家发明专利(国家科技攻关计划2000a)；福建农林大学研制的苏云金芽孢杆菌遗
9、传改良工程菌 TSl6等杀虫剂获得化学工业部的农药生产证、农业部的农药登记证和出口证(国家科技攻关计划2000b)；南开大学对苏云金芽孢杆菌广谱基因工程菌的构建及新型高效菌株15A3的研究与开发己通过验收和鉴定(国家科技攻关计划2000c)。中山大学已构建出遗传稳定的高产高效杀虫 Bt 工程菌 TnY 并申请国家发明专利。此外，中国科学家还从 Bt 资源中分离克隆了 CrylAcl0和 CrylFb3等新型杀虫蛋白基因，并通过基因重组或转移，分别得到了杀虫毒力明显提高或兼有杀虫和防病作用的苏云金芽孢杆菌、荧光假单孢菌和枯草芽孢杆菌菌株；通过转座子诱变和接合转移技术获得了防病增产作用显著的荧光假
10、单孢菌；通过构建致病基因 hrp 缺失的工程菌株可降低水稻白叶枯病病情指数近50(中山大学网页)。(2)转基因病毒杀虫剂。国外近年尝试通过基因工程方法将不同的外源杀虫基因导入野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)，研究取得了良好的进展。中国科学家将蝎神经毒素基因(AalT)和缺失蜕皮激素 UTP 葡萄糖苷转移酶(egt-)基因导入棉铃虫核多角体病毒(HasNI)，得到了杀虫速度明显加快的重组 HaSNPV(黄大防2003)。武汉病毒所在国际上首次成功构建了3株缺失 egt 基因的霞组中国棉铃虫病毒，被农业部“农业微生物遗传工程体安全管理委员会”审批为安全性等级 I 级，分别于1998年
11、、1031999年、2000年批准进入田间中间试验和环境释放，其中重组棉铃虫病毒1号是中国第一例通过国家安全性评估进入田间中间试验和环境释放的重组病毒杀虫剂，目前正进行中试生产，可望成为中国第二代病毒杀虫剂(中国科学院武汉病毒研究所)。中山大学在国内外首次构建了杀虫速度提高1倍以上的重组粉纹夜蛾(Tnchoplusiani)核多角体病毒 THAT35并已申请专利，这是中国构建的第一株对害虫具有迅速麻痹作用的基因工程杆状病毒。中山大学还与荷兰农业大学合作，构建出重组甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)核多角体病毒 SeXD，经农业部农业生物基因工程安全委员会评审，安全等级为 I 级(国家
12、科技攻关计划2000d)。武汉大学自1995年起进行了蔬菜害虫基因工程病毒杀虫剂的环境释放和生态学效应研究，构建出高效表达 Bt 杀虫晶体蛋白的重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒，已于2002年通过湖北省科技厅的鉴定(教育部科技发展中心2003)。(3)防治植物霜冻的转基因工程菌。冰核活性细菌是诱发和加重植物霜冻的主要因素，降低冰核活性浓度可有效减少植物霜冻的发生。因此，利用无冰核活性细菌的生态位点和营养竞争作用可以减少冰核细菌的数量，有效减轻植物霜冻现象的发生。防治植物霜冻的无冰核活性工程菌于1982年研制成功，1987年进入田间试验，防治草莓霜冻效果达70以上(朱守一1999)。(4)防治果树根
13、癌病的放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)K1026。这一工程菌的防病效果和稳定性高于自然株 K84。通过酶切去除 pAgK84质粒中负责细菌接合转移的编码基因及其相邻的 EcoRI 片段并经同源交换构建工程菌 K1026，增强了生物防治效果的稳定性。1991年和1992年，这种新构建的工程菌以 NoGall 为商品名在澳大利亚和美获准登记，成为世界上第一例商品化生产的植物病害生物防治基因工程细菌制剂，目前已在澳大利亚、美国、加拿大、日本和西欧的一些国家推广应用(朱守一1999)。(5)对昆虫真菌的遗传改良。白僵菌(Beauveria)和绿僵菌(Metarhizi
14、um)是所有记载的800多种昆虫病原真菌中应用效果最好的菌种，这类微生物杀虫剂可以多次感染害虫而引起流行，但侵染过程易受环境医 I 素影响，毒力发挥较慢。昆虫真菌分子生物学和生物技术研究在国内外起步稍晚，但近年来某些关键技术己取得突破。中国在国际上首次建立了球孢白僵菌(且 bassiana)的农杆菌转化体系，并从该菌中克隆了类枯草杆菌蛋白酶基因(Bbprl)、几丁质酶基因(Bbehitl)和真菌孢子形成相关基因。新构建的含有前两种基因的工程菌较单一 Bbprl 基因工程菌杀虫毒力提高近 l 倍，侵染致病时间缩短近一半(黄大肪2003)。2.2转基因微生物肥料1980年代以来，采用分子技术对外源
15、固氮基因及其调控基因进行转移而构建出的新型重组固氨微生物已进入大规模田间试验和商品化生产。例如，日本率先将 nifA 固氮基因导入联合固氮菌而构建出耐铵工程菌；美国 Bosworth 等构建成含 rtifA 和 dctABD 等多种固氮相关基因的重组根瘤菌，在田问试验中表现良好(朱守一1999)：美国 ResearchSeeds 公司的转基因中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)RMBPC-2已于1997年获准进行有限商品化生产，这是美国环保局批准进入商品化生产的第 例属间重组固氮微生物(刘谦等2001)。中国的固氮研究在固氮基因的克隆、调控、耐铵、泌铰及高效固氮菌株构
16、建等方面取得重大进展。已分离鉴定出 lO 余株高固氮活性的固氨菌株，构建了一系列耐铵、泌铰高效固氮工程菌株，比野生菌有更好的节肥增产效果(周永春等2001)。中科院上海植生所、中国农科院原子能所、中科院植物所、华中农业大学、广西大学等单位在重组固氨菌的研制方面取得了较多成果。1997 1999年间已有多种重组固氮菌经批准进行了中间试验和环境释放。华中农业大学、中国科学院植生所、广西大学等单位构建了含有吸氢酶基因 hup、三叶草素基因呶、竞争结瘤基因 nfeC、脯氢酸脱氢酶基因 putA 和结瘤基因 nod 的多株工程菌，部分菌株室内条件下固氮效率和竞争结瘤能力有明显提高。中国农业大学、中国农科
17、院原子能所、北京大学等单位克隆了固氮酶正调控基因 nifA，一般氮代谢调节基因ntrC、ntrA、皿 nB，四碳二羧酸转移酶基因 dctA，吸氢酶基因 hup，固氮酶负调控基因nifL，固氮酶活性抑制基因的突变基因 draT 以及铵运输蛋白基因 amT、gA、mebI 等基因，经重组修饰的耐铵工程菌能显著提高固氮效率，有效减轻铵对固氮的阻遏作用，但田间效果常受到许多生态因子的影响而不太稳定。中国农科院原子能所、广东省微生物研究所和中科院上海植生所等单位研制出了具有显著节肥促生作用的基因工程联合固氮菌剂ACl541，已通过农业部生物基因工程安全委员会的审批，获准在辽宁省进行商品化生产。中科院植物
18、所和北京农业大学联合研制出的玉米联合固氮菌 E577和玉米联合固氮耐铵工程菌 E7已申请国家专利，其中玉米固氮工程菌 E7已获准在黑龙江省进行环境释放。华中农业大学、广西农学院和黑龙江省农科院等单位构建的大豆花生基因工程根瘤菌已于1993年通过农业部组织的专家鉴定，1992-1995年在广西的不同地区进行了18个小区试验并在8个地区44个县进行了6882万亩的大田推广应用，效果明显(星火计划2000)。2.3应用转基因微生物生产饲料酶制剂一些饲料酶的生产已开始利用基因工程技术。以基因工程菌生产的饲料酶也称重组酶。黑曲霉(AspergiUus niger)、米曲霉(A oryzae)和无花果曲霉
19、(Aficuum)等丝状真菌可用于生产包括酶在内的重组蛋白(林藩平2000)。中国农科院饲料所和生物技术研究中心从1996年开始从黑曲霉中克隆植酸酶基因，研制出能高效表达植酸酶的重组毕氏酵母用于生产植酸酶，1999年底完成中试和试生产，2000年初通过农业部基因工程安全委员会审查，获准商业化生产(国家863计划2000b)。重组酵母表达的中性植酸酶量比原始的天然菌株提高4 000倍以上，比专利中报道的且国外正在用于生产的畜禽用酸性植酸酶的基因工程曲霉高近 l 倍，该成果已于2000年5月通过农业部鉴定(挑战报2000)。3、转基因微生物在医药生产领域的应用在医药生产方面，转基因微生物可用于生产
20、基因工程疫苗和基因工程药物。其中基因工程疫苗可分为兽用和人用两种类型，基因工程药物主要用于人类疾病的治疗。3.1基因工程疫苗(1)兽用基因工程疫苗。兽用基因工程疫苗的研究与开发所涉及的病原包括细菌、病105毒和寄生虫，疫苗使用对象有牛、马、猪、羊、犬、禽、兔、鱼和其他野生动物。疫苗的类型有：灭活细菌、病毒和寄生虫亚单位疫苗；活的微生物疫苗，即基因缺失活疫苗；活载体疫苗，即基因重组活疫苗等3大类。据不完全统计，国内外已有40多种兽用基因工程疫苗实现了商业亿生产，100多种兽用基因工程疫苗正在进行野外试验阶段或获得了专利，还有360多种处于试验室研究阶段(刘谦等2001)。 大肠埃希氏菌 K88、
21、K99抗原和 LTB 类毒素单价或多价皿单位疫苗已在中国、美国、加拿大等国家批准上市：传染性生血坏死性病毒 gP 和 Vp2抗原亚单位灭活疫苗、绵羊绦虫亚单位灭活疫苗等也获批准注册：出血性败血症病毒、口蹄疫病毒、鱼结节性病毒、伪结核棒状杆菌、流产布鲁氏菌、多种泰勒虫等病原的亚单位疫苗已在进行野外试验或已获得专利。中国军事医学科学院等单位成功制备了双价大肠杆菌疫苗。中国对日本血吸虫病亚单位疫苗、牛流行热亚单位疫苗、牛布鲁氏菌亚单位疫苗和牛传染性鼻气管炎亚单位疫苗等的研究也取得了较好的进展。各国政府对基因工程活疫苗的注册和野外释放的审批持慎重态度，对基因重组载体活疫苗的审批更为严格。已批准注册的基
22、因插入或缺失活疫苗有：多杀性巴氏杆菌 LoxA 基因缺失疫苗，肠炎沙门氏菌 Aro A、Aro L 和 Sefa 基因缺失疫苗。鼠伤寒沙门氏茁 Am A 基因缺失疫苗，绵羊流产沙门氏菌 Stm 反转变异疫苗，胸膜肺炎放线杆菌 APX 基因缺失疫苗，气水假单孢菌基因缺失疫苗，鹦鹉热衣原体 NTG 基因突变株疫苗，伪狂犬病病毒 TK 基因缺失疫苗等。已注册的基因重组载体活疫苗有：牛病毒性腹泻病毒载体活疫苗，载体为痘苗病毒；狂犬病病毒基因重组活疫苗，载体为痘苗病毒哥本哈根等。另有牛瘟病毒、牛流行性白血病病毒、牛鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒、兔病毒性出血症病毒等的基因工程活疫苗和鸡痘一新城疫二联基因工程活
23、疫苗已被批准进行野外试验。鼠伤寒沙门氏菌 Aro A 基因缺失疫苗、伪狂犬病病毒基因缺失疫苗和狂犬病病毒糖蛋白的重组疫苗已被多个国家批准注册或进入商业化生产。中国研制的伪狂犬病 gc 和 gI 基因缺失疫苗也已开始应用， 用基因重组技术构建成的大肠埃希氏菌株生产的疫苗已实现商品化生产。在“863”计划中，对猪瘟、猪囊虫病、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、禽流感、鸡产蛋下降综合症等病原，在病毒载体的构建，免疫原性基因的分离鉴定、克隆和表达，基因表达产物的生物学功能等方面进行了研究，其中禽流感活载体疫苗、鸡传染性法氏囊病活载体疫苗、鸡马立克氏病三价基因
24、工程疫苗已取得一定效果。华中农业大学、四川农业大学已成功研制出猪伪狂犬病基因缺失疫苗，宁夏大学研制出的犊牛、羔羊腹泻双价基因工程疫苗已获批准生产，复旦大学合成的口蹄疫多肽疫苗已进入田间安全试验阶段，扬州大学农学院构建了马立克氏病毒gB 基因的重组禽痘病毒(hc360制药工业2003)。哈尔滨兽医研究所开展了新生仔猪腹泻大肠杆菌 K88K99双价基因工程菌苗、K88K99-987P 和 K88一 K99-F41三价基因工程菌苗的研究；研制成功鸡传染性喉气管炎和鸡痘二价基因工程疫苗、禽流感和鸡痘二价基因工程疫苗，均已通过国家生物安全评估；构建了表达鸡贫血病毒 VPlVP2基因的重组火鸡疱疹病毒、表
25、达马立克氏病毒 gB 基因的重组火鸡疱疹病毒、表达传染性法氏囊病毒 VP2的重组鸡痘病毒、表达猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因的重组伪狂犬病病毒；研制了禽流感H5H7亚型血凝素基因疫苗、马立克氏病 gB 基因疫苗和新城疫病毒 F 基因疫苗；猪繁殖与呼吸综合征重组 N 蛋白-ELISA 检测试剂盒、伪狂犬病重组窟 E 蛋白ELISA106检测试剂盒、禽流感重组 NP 抗原和 ELISA 检测试剂盒等已推向市场(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所网页2003)。(2)人用病毒工程突变株与重组减毒活疫苗。人用基因工程疫苗包括工程减毒疫苗株、杂合减毒株，以及病毒载体重组株等3种类型，此外，用于免疫治疗和
26、基因治疗的重组病毒也是重要的治疗人类疾病的基因工程微生物。1986年，第一例基因工程疫苗重组乙肝疫苗由Merck 公司开发成功并获准在欧洲上市，其他如口蹄疫病毒抗原、流感疫苗等都可用转基因的方法生产。中国的哺乳动物基因工程乙肝疫苗于1992年投放市场，预防痢疾的冻干口服福氏、宋内氏痢疾双价活菌苗于1998年上市，口服重组 B 亚单位庙体霍乱疫苗霍乱于2000年上市，血吸虫疫苗、出血热疫苗等正在进行临床试验(国家863计划2COOt)。3.2转基因微生物生产基因工程药物通过基因工程技术将外源目的基因经重组技术导入大肠杆菌、酵母等微生物或动物细胞，通过微生物发酵、动物细胞培养技术可以生产出大量多肽
27、或蛋白质药物用于疾病治疗。1977年，美国科学家 Boyer 等首次将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成出14肽；1978年日本科学家板仓等使人生长激素191肤在大肠杆菌中表达成功；1979年美国第一家遗传工程公司基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素；1982年基因技术公司将其开发的基因工程人胰岛素推向市场(分子生物学信息网)。据估计，目前发达国家中23糖尿病患者治疗所用的胰岛素来自基因工程产物(张宁2000)。美国基因工程药物销售额1995年为48亿美元，1997年超过60亿美元，且每年以20速度增长。2000年全球基因
28、工程药物的产值和销售额已超过200亿美元。1970年代至今，世界上已获准上市治疗疑难病的基因工程药品约120余种，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿病、不孕症等疑难病。另有近400多种处于各期临床研究阶段，3 000多种处于临床前研究开发阶段(唐冬生等1999)。中国研制成功的治疗疑难病的基因工程药品有20多种。世界上销售额前 lO 位的生物技术药物我国已能生产8种，另有9种药物已完成或正在进行临床试验，9种进入中试，18种处于实验室研究阶段，其中大部分具有自主知识产权。中国基因工程药物的销售额从1996年的22亿元增加到2000年的20亿元，年增长率高达80(生物科技在线2003)。摘自国内外转基因微生物研究与环境释放现状综述
