DB63T - 实验用喜马拉雅旱獭 遗传质量控制.docx

1、ICS 65.020.30 CCS B 40/49 DB63青 海 省 地 方 标 准DB 63/ TXXXXXXXXX实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 遗 传 质 量 控 制（报批稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施青 海 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布IDB63/ TXXXXXXXXX前 言本 部 分 按 照 GB/T 1.1-2009 给 出 的 规 则 编 写 。 本 部 分 由 青 海 省 科 学 技 术 厅 提 出 并 归 口 。 本 部 分 起 草 单 位 ： 青 海 喜 马 拉 雅 动 物 实 验 中 心 有 限 公 司 、 青

2、海 央 宗 药 业 有 限 公 司 、 青 海 省 野 生 动 植 物 保 护 协 会 。 本 部 分 主 要 起 草 人 ： 吴 天 一 、 范 微 、 张 评 浒 、 徐 楠 、 张 玲 、 周 国 华 、 张 毓 。1DB63/ TXXXXXXXXX实验用喜马拉雅旱獭 遗传质量控制1 范围本 部 分 规 定 了 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 遗 传 分 类 、 封 闭 群 的 繁 殖 方 法 、 遗 传 质 量 监 测 。 本 部 分 适 用 于 封 闭 群 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 遗 传 质 量 控 制 和 管 理 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文 件对

3、 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡 是注 日期的 引用 文件 ， 仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 14923 实 验 动 物 哺 乳 类 实 验 动 物 的 遗 传 质 量 控 制3 术 语 和 定 义3.1 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 Experimental Marmota Himalayana指经人 工饲 育适 应青 藏高 原低氧 环境 ， 对 其携 带的 病原微 生物 和寄 生虫 实行 控制， 遗传 背景 明确

4、或 者 来 源 清 楚 ， 用 于 科 学 研 究 、 教 学 、 生 产 和 检 定 等 其 他 科 学 研 究 的 青 藏 高 原 特 有 种 鼠 喜 马 拉 雅 旱 獭 。3.2 封 闭 群 或 远 交 群 Closed colony or outbred stock以非近 亲方 式进 行繁 殖的 实验用 喜马 拉雅 旱獭 群体 ， 在不 从外 部引 入新 的个 体的条 件下 ， 至 少繁 殖 4代 以 上 ， 封 闭 群 亦 称 远 交 群 。4 封 闭 群 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 繁 殖 方 法按 照 GB14923附 录 A封 闭 群 动 物 繁 殖 方 法 进 行

5、 。5 封 闭 群 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 遗 传 质 量 监 测5.1 遗 传 质 量 要 求5.1.1 具 有 明 确 的 遗 传 背 景 资 料 ， 来 源 清 楚 ， 有 较 完 整 的 资 料 （ 包 括 种 群 名 称 、 来 源 、 遗 传 基 因 特 点 及 主 要 生 物 学 特 性 等 ） 。5.1.2 用 于 保 种 及 生 产 的 繁 殖 谱 系 应 清 楚 完 整 ， 繁 殖 方 法 科 学 合 理 。 保 持 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 基 因 异 质 性 和 多 态 性 ， 避 免 近 交 系 数 随 代 数 增 加 而 过 快 上 升 。 遗 传

6、 谱 系 鉴 定 参 照 喜 马 拉 雅 旱 獭 遗 传 进 化 分 析 方 法 进 行 ， 见 附 录 A。5.1.3 经 遗 传 检 测 （ 微 卫 星 分 子 标 记 ） 证 明 基 因 频 率 稳 定 ， 为 相 同 种 群 。 微 卫 星 分 子 标 记 检 测 方 法 见 附 录 B。5.2 遗 传 检 测 方 法2DB63/ TXXXXXXXXX5.2.1 喜 马 拉 雅 旱 獭 遗 传 进 化 分 析 方 法 ， 见 附 录 A。5.2.2 微 卫 星 分 子 标 记 检 测 方 法 ， 见 附 录 B。5.2.1 抽样按 表 1要 求 。表1 抽 样 数 量生产种群旱獭数量

7、取样数量（只）100 只以上 30100 只以下 155.2.2 微 卫 星 分 子 标 记 的 选 择选 择 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 13个 具 有 高 度 多 态 的 位 点 作 为 遗 传 检 测 的 微 卫 星 分 子 标 记 。5.2.3 群 体 评 价5.2.3.1 群 体内 遗传 变异 采用平 均有 效杂 合度 指标 或群体 平衡 状态 进行 度量 。 所用分 子标 记或 生化 标 记 能 反 映 群 体 基 因 多 态 性 。5.2.3.2 当 平 均 有 效 杂 合 度 在 0.50 .7 时 ， 群 体 为 合 格 封 闭 群 实 验 旱 獭 群 体 。 或 用

8、 群 体 是 否 达 到 平 衡 状 态 来 判 断 定 ， 如 果 没 有 达 到 平 衡 状 态 ， 说 明 群 体 的 基 因 频 率 或 基 因 型 频 率 发 生 变 化 ，该 封 闭 群 判 为 不 合 格 。5.2.3.3 喜 马 拉 雅 旱 獭 Cytb 序 列 进 行 同 源 比 对 与 遗 传 进 化 分 析 。5.3 检 测 频 率封 闭 群 实 验 喜 马 拉 雅 旱 獭 每 年 进 行 一 次 遗 传 质 量 检 测 。3DB63/ TXXXXXXXXX附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 喜 马 拉 雅 旱 獭 遗 传 进 化 分 析 方 法A.1 实 验 材 料

9、与 仪 器A.1.1 主 要 试 剂DNA Marker、 RNase、 高 保 真 Taq 酶 、 琼 脂 糖 、 琼 脂 粉 、 Tris 碱 、 质 粒 抽 提 试 剂 盒 、 AMP、 IPTG、 -gal、 Goldview、 异 丙 醇 、 CaCl2、 甘 油 、 QIAGEN 动 物 组 织 与 全 血 DNA 提 取 试 剂 盒 。A.1.2 实 验 室 常 用 溶 液 的 配 置 方 法TE 缓 冲 液 （ pH8.0） ： 10mM Tris-HCl， 1mM EDTATAE 母 液 （ 50） ： 242g Tris 碱 ， 57.1ml 冰 乙 酸 ， 100ml 0

10、.5mol/L EDTA(pH8.0) 定 容 至 1 升 。 凝 胶 加 样 缓 冲 液 母 液 （ 6） ： 0.25% 溴 酚 蓝 ， 0.25% 二 甲 苯 青 FF， 30% 甘 油 水 溶 液 4 贮 存 。 Goldview 染 液 ： 50ml TAE 缓 冲 液 中 加 入 Goldview 1L。A.1.3 仪器台 式 高 速 离 心 机 、 核 酸 蛋 白 定 量 仪 、 超 净 工 作 台 、 电 泳 槽 、 稳 压 稳 流 电 泳 仪 、 PCR 仪 、 IQ5 荧 光 定 量 PCR 仪 、 系统 化学 发光 凝胶成 像仪 、 恒 温水 浴、 隔 水式恒 温生 化培

11、 养箱 、 旋 涡混合 器 、 电子 分析 天平 、 恒 温 摇 床 、 烘 箱 、 手 提 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅 、 磁 力 搅 拌 器 。A.2. 实 验 方 法A.2.1 喜 马 拉 雅 旱 獭 线 粒 体 Cytb 基 因 检 测 方 法 的 构 建A.2.1.1 引 物 设 计参照 GenBank 基 因数 据库 中喜马 拉雅 旱獭 线粒 体 cyt-b 基 因的 核苷 酸序 列 ， 设 计如下 引物 序列 ， 由 南 京 金 斯 瑞 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成 。WcytbF1: 5-GCTACAGCTTTCATAGGCTATG -3 WcytbR1: 5-C

12、TATGACTAGAGCTGCGATG -3A.2.1.2 旱 獭 DNA 的 提 取1) 将 冻 存 的 旱 獭 肝 组 织 样 品 剪 成 糊 状 后 ， 加 入 200l 缓 冲 液 GA， 振 荡 悬 浮 ， 然 后 加 入 4l RNase (100mg/mL)， 振 荡 15 秒 ， 室 温 放 置 5min。2) 加入 20l 的 蛋 白 酶 K 溶 液 ， 混 匀 ， 56 放 置 过 夜 。3) 加入 200l 缓 冲 液 GB， 充 分 颠 倒 混 匀 ， 70 放 置 10min,溶 液 变 清 后 ， 简 短 离 心 去 除 管 盖 内 壁 的 水 珠 。4) 加入 2

13、00l 无 水 乙 醇 ， 充 分 振 荡 混 匀 15 秒 ， 简 短 离 心 去 除 管 盖 内 壁 的 水 珠 。5) 将 上 述 所 得 溶 液 和 絮 状 沉 淀 加 入 到 吸 附 柱 CB3 中 (吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 )， 12， 000rpm 离 心 30 秒 ， 倒 掉 废 液 ， 将 吸 附 柱 CB3 放 回 收 集 管 中 。4DB63/ TXXXXXXXXX6) 向吸附 柱 CB3 中 ， 加入 500l 缓 冲 液 GD， 12,000rpm 离心 30 秒 ， 倒 掉废 液 ， 将 吸附 柱 CB3 放 回 收 集 管 中 。7) 向 吸 附 柱

14、中 加 入 700l 漂 洗 液 PW， 12,000rpm 离 心 30 秒 ， 倒 掉 废 液 ， 将 吸 附 柱 CB3 放回 收 集 管 中 。8) 向 吸 附 柱 中 加 入 500l 漂 洗 液 PW， 12,000rpm 离 心 30 秒 ， 倒 掉 废 液 。9) 将 吸 附 柱 CB3 放 回 收 集 管 中 ， 12,000rpm 离心 2min， 倒 掉 废 液 。10) 将 吸 附 柱 CB3 室 温 放 置 数 分 钟 ， 以 彻 底 晾 干 吸 附 材 料 中 残 余 的 漂 洗 液 。11) 向 吸 附 柱 CB3 吸 附 膜 中 间 部 位 悬 空 滴 加 10

15、0l 洗 脱 液 TE， 室 温 放 置 2-5min， 12,000rpm 离心 2min， 将 溶 液 收 集 到 新 的 离 心 管 中 ， 放 置 于 -20 保 存 。A.2.1.3 核 酸 浓 度 的 测 定A.2.1.3.1 测 定 原 理具有共 轭双 键的 有机 分子 ， 对 紫外 光有 强烈 吸收 ， 核 酸分子 中的 碱基 就是 共轭 双键 ， 因 此也 强烈 吸 收 紫 外 光 。 核 酸 的 最 大 吸 收 波 长 为 260nm， 吸 收 谷 在 230nm。 核 酸 的 这 一 物 理 特 征 为 测 定 核 酸 溶 液 的 浓 度提供 基 础 。 在 波长 为 2

16、60nm 的 光程 为一 个吸 收单 位 (A260=1)相当 于双 链 DNA 浓 度为 50g/ml， 单 链 RNA 为 40g/ml。 所 以 测 出 溶 液 的 A260 值 后 既 可 以 据 此 计 算 它 的 浓 度 。A.2.1.3.2 测 定 步 骤1） 使 用 1cm 光 程 石 英 比 色 杯 ， 以 超 纯 水 调 好 仪 器 零 点 。2）将 20l 核 酸 样 品 稀 释 到 1mL 去 离 子 水 中 。3） 测 定 并 记 录 A260 与 A280 的 比 值 。A.2.1.4 PCR 扩 增 Cyt-b 基因PCR 扩 增 Cyt-b 基 因 反 应 体

17、系 :组分 体积H2O 31.5l10buffer 5lMgCl2 2.5 mM 4ldNTP 2.5 mM 4lHcytbF1 2lHcytbR1 2lDNA template 1lTaq-polimerase (5u/l) 0.5lPCR 扩 增 Cyt-b 基 因 反 应 条 件 :循环 温度 时间1 94 5min94 30sec55 30sec3072 30sec1 72 10min4 30min5DB63/ TXXXXXXXXXA.3. 序 列 比 对 与 遗 传 进 化 分 析利用 DNAstar 5.0 和 MEGA4.0 软 件 对 喜 马 拉 雅 旱 獭 Cytb 序 列

18、进 行 同 源 比 对 与 遗 传 进 化 分 析 。6DB63/ TXXXXXXXXX附 录 B（ 规 范 性 附 录 ） 喜 马 拉 雅 旱 獭 微 卫 星 遗 传 标 记 的 检 测 方 法B.1 仪 器 设 备PCR扩 增 仪 、 遗 传 分 析 仪 、 凝 胶 成 像 仪 、 高 速 冷 冻 离 心 机 、 恒 温 水 浴 锅 、 0.001g级 电 子 天 平 、 pH计 、 微 量 核 酸 测 定 仪 、 移 液 器 、 匀 浆 器 、 电 泳 仪 、 电 泳 槽 。B.2 主 要 试 剂酚 :氯 仿 :异 戊 醇 (25:24:1, V:V)、 氯 仿 、 异 丙 醇 、 70

19、%乙 醇 、 TE(pH8.0)、 RNaseA、 蛋 白 酶 K、 电 泳 试 剂 、 PCR扩 增 试 剂 、 SNET裂 解 缓 冲 液 （ 配 方 见 分 子 克 隆 实 验 指 南 第 三 版 ） 。B.3 微 卫 星 位 点选取13 个微 卫星 位点 对喜 马拉雅 旱獭 封闭 群进 行遗 传检测 。 微卫 星各 位点 的 名称 、 引 物序 列 、 Gene bank登 录 号 、 PCR 反 应 退 火 温 度 见 表 。表 微 卫 星 各 位 点 的 名 称 、 引 物 序 列 、 Genbank 登 录 号 、 最 佳 退 火 温 度位点 引物序列（5-3） Genbank

20、登录号 退火温度（）SSR1 GAAATAGGCTGGTCCGTGCATACTTGATAGATGGTGGTG EF676085 60SSR2 GTCTGTTCAGGAGCCATCCTCATCCAGCCTTAGTGTAG EF676086 60SSR3 GATGGGTCAAATAATGGTACATGTGAAGGGTTGGGGTT EF676088 62SSR4 GGGAAAACCAAAATCTGAACACAGCAAATCTCCCACCA EF676087 56SSR5 ACATTGCTACCACTGCTGCTCCGACCCAGACTGAATTACATCAT EF676090 52SSR6 CTT

21、CTTTCCTTCCCCATAAACTCAAGTGAGACCCTGT EF676084 52SSR7 GCCTGTTTGAAGACTGATTGACCTAAAGAAATGCTAT EF555519 50SSR8 TCAGAAATGCAACCCAGACGCCCCAACAGAAGGAACT EF676089 56SSR9 AGGGGAACAGAACCAAAAGGGTTTCTTCCAGGGACAAAGCACCATC AY197780 56SSR10 ATCCGTCCAATAAAGAAATTCGTTTCTTGTGGCTCAGTGGTCAGATG AY197781 56SSR11 CATTTAGACGCA

22、CATTTTGGGGATGGAGAATGAGGAAG AY197782 56SSR12 AATATGTTAAGGCAGTTCTAGCGTTTCTTCCTGATATGGAAAGATGATGT AY197783 52SSR13 CCTGTGTGAGTCCTGGAGTCAGCCATTTAGGTTACATCTGC AY197784 547DB63/ TXXXXXXXXXB.4 实 验 方 法B.4.1 DNA提 取B.4.1.1 取 旱 獭 尾 部 组 织 ， 将 其 切 成 小 块 转 入 EP管 ， 加 入 适 量 SNET裂 解 缓 冲 液 后 用 组 织 匀 浆 器 研 磨 。B.4.1.2

23、加 入 等 体 积 酚 :氯 仿 :异 戊 醇 ， 反 复 颠 倒 混 匀 ， 室 温 振 荡 30 min。B.4.1.3 10000 r/min离 心 10 min后，吸取上清液至新EP管，加入等体积氯仿，反复颠倒混 匀。B.4.1.4 继 续 10000 r/min离 心 10 min后 ， 吸 取 上 清 液 至 新 EP管 ， 加 入 等 体 积 异 丙 醇 ， 混 匀 后4 10000 r/min离 心 沉 淀 DNA。B.4.1.5 弃 去 异 丙 醇 上 清 ， 加 入 1 ml 70%的 乙 醇 ， 反 复 颠 倒 洗 涤 沉 淀 。B.4.1.6 再 10000 r/min

24、离 心 10 min， 弃 去 70%的 乙 醇 ， 室 温 空 气 干 燥 沉 淀 约 15 min。B.4.1.7 加入50 L TE， 4 静 置 过 夜 溶 解 DNA。B.4.1.8 取2 L 上 述 DNA溶 液 ， 用 微 量 核 酸 测 定 仪 对 其 质 量 进 行 检 测 。B.4.2 PCR反 应 和 电 泳 检 测B.4.2.1 PCR反 应体 系总 体积 为25 L。 其中， 10Buffer 2.5 L 、 10 mM dNTPs 0.5 L、 10 mM上/下游引物各0.5 L、50 ng/L模板DNA 2.0 L、Taq DNA聚合酶1 U，用ddH2O将 反

25、应 体 系 补 充 至 25.0 L。B.4.2.2 PCR反 应条 件为 ： 94预 变 性 5 min； 94 变性 60 s， 55退 火60 s， 72延 伸9 0 s， 共 35个 循 环 ； 72 延 伸 10 min。B.4.2.3 取 PCR扩 增 产 物 5 L， 通 过 加 溴 化 乙 锭 的 1%琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 检 测 。B.4.3 STR扫 描PCR扩 增产 物经 琼脂 糖凝 胶 电泳检 测合 格后 ， 剩 余PC R产物分 别以 Rox、 6-Fam、 Hex、 Tamra四个 标记 物 标 记 。 取 2.0 l标 记 样 品 上 机 STR检

26、测 。B.5 数 据 处 理通过软 件给 出波 峰获 得扩 增产物 的分 子量 大小 。 利 用 软件 计算 各微 卫星 位点 的基因 频率 、 观 察等 位 基 因 数 、 有 效 等 位 基 因 数 、 基 因 平 均 杂 合 度 及 Shannon指 数 。B.6 结 果 判 定B.6.1 平均杂 合度 在 0 .5 0.7， 且期望 杂合 度与 观测 杂合 度经卡 方检 验无 明显 差异 时， 为 合格 的封 闭 群 喜 马 拉 雅 旱 獭 群 体 。8DB63/ TXXXXXXXXXB.6.2 首 先 得 到 各 个 位 点 上 各 基 因 频 率 、 基 因 型 频 率 的 实 际

27、 值 ， 然 后 计 算 出 基 因 频 率 和 基 因 型 频 率 的 预期值 。 用 实际 值和 预期 值比较 ， 通 过卡 方检 验， 可知被 监测 群体 是否 达到 平衡状 态 。 如果 没有 达 到 平 衡 状 态 ， 说 明 群 体 的 基 因 频 率 或 基 因 型 频 率 发 生 变 化 ， 该 封 闭 群 喜 马 拉 雅 旱 獭 群 体 判 为 不 合 格 。B.6.3 结 果 报 告根 据 判 定 结 果 对 被 检 测 的 封 闭 群 喜 马 拉 雅 旱 獭 群 体 做 出 检 测 报 告 。1项 目 计 划 编 号 ： 2017-QHBZD-053实验用喜马拉雅旱獭 遗

28、传质量控制 地方标准编制说明联 系 人：张玲 联系电话：13901358277 编制单位：青海央宗药业有限公司 时 间：2018 年 6 月 20 日2一、工作简况1.任务来源2017 年 4 月 10 日 ， 由青 海央宗药 业有限 公司申请 地方标 准 的 立 项 ， 根 据 青 海 省 质 量 技 术 监 督 局 下 达 的 关 于 印 发 青 海 省 2017 年 地方 标 准制 修订项 目计划的 通知 (青 质监标 函 201774 号)项目计划编号 2017-QHBZD-053， 批 准 实 验 用 喜 马 拉 雅 遗 传 质量控制(DB63)地方标准的制定。2.起草单 位： 青

29、海 央宗药 业有限公 司 、 青 海喜马拉 雅动物 实验中心有限公司、青海省野生动植物保护协会。3.主要起草人姓 名 性别 职 务 /职 称 工作单位 任务分工青 海 高 原 医 负责国内外相关标准和技术资料的收集。 负责标准起草和编制说明编写等组织、协调、吴天一 男 院士学研究院审核等工作。青 海 省 地 方 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责病 预 防 控 制 标准起草和编制说明范微 女 研究员所 编 写 等 组 织 、 协 调 、 校对等工作。青 海 央 宗 药 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责标准起草和编制说明徐楠 男 工程师业 有 限 公 司编写等工作。青 海 喜 马

30、拉 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责标准起草和编制说明张玲 女 总经理雅 实 验 动 物编写等工作。3中 心 有 限 公司青 海 喜 马 拉 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责雅 实 验 动 物 标准起草和编制说明中 心 有 限 公张评浒 男 研究员司编写、审核等工作。青 海 省 野 生 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责动 植 物 保 护 标准起草和编制说明张毓 男 研究员协会 编写、审核等工作。青 海 央 宗 药 负责国内相关标准和技术资料的收集。 负责标准起草和编制说明周国华 男 药师业 有 限 公 司编写工作。二、制定（修订）标准的必要性和意义科学家研究古人类基因组

31、发现，3500 年前人类就开始携带乙肝 病毒，至今，全世界还有 2 亿多人感染乙肝病毒。中国肝炎防治基 金会公布的数据显示，乙型肝炎病毒每年导致全世界 100 多万人死 亡。中国属于肝炎负担最重的国家，约 1 亿人为慢性乙肝病毒感染 者，占全球慢性乙肝病毒感染者的三分之一，却只有 9%的乙肝感染 者得到检测和治疗。目前还没有任何药物能够治愈乙肝，因此，迫 切需要合适的动物模型进行精准治疗和靶向治疗的研究。用于乙肝 研究的动物有北美的东方土拨鼠和北京鸭等，但由于土拨鼠仅产于 北美，且价格昂贵，难以在国内广泛应用，北京鸭与人类种源差距 大，不能复制出更多的和人类相似的感染过程，可喜的是喜马拉雅 旱

32、獭可以。喜马拉雅旱獭（Marmota himslayana Hodgson） 在 青 海 省 分 布4广，数量多，是我国正在开发的具有自主知识产权的实验用动物新 品种。1984 年 ， 取 材 检 测 发 现 ， 3719 份中有 24 份发现旱獭(WHV)表 面抗原阳性，1987 年刘寿鹏等再次证实在喜马拉雅旱獭中存在类似 于土拨鼠肝炎病毒的感染,并且显示喜马拉雅旱獭能人工感染土拨 鼠肝炎病毒，标本送到美国接种东方土拨鼠进行感染实验成功，因 此，认定喜马拉雅旱獭已被当作可替代美洲旱獭研究人类乙型肝炎 病 毒 (HBV)难 得 的 、 天 然 的 、 理 想 的 动 物 模 型 。 不 仅 如

33、 此 ， 由 于 其 生 物 学特性 以及与美 洲旱獭 （东方土 拨鼠 ） 的亲缘关 系， 在 人类乙 型肝炎、艾滋病、心血管疾病、肥胖、肿瘤、烈性传染病(如鼠 疫 ) 发病 机理研究 以及相 关药理学 、 毒理 学评价、 化 妆品制 造等 诸 多领域 具有广泛 的应用 前景 。 同 时 ， 由 于其具有 体型中 等、 繁 殖 周期短 、 易于实 验操作 等 ， 目前 已经被 用于若干 重要疾 病如乙 型 肝炎 （ HBV） 、 线 粒体毒 性 、 高脂 血症等 动物模型 的创建 。 随着 相关研究的深入，喜马拉雅旱獭得到国内外越来越广泛的关注， 其 质量标 准化也就 显得迫 切而重要 。 因

34、此， 实验用喜 马拉雅 旱獭 地 方标准 的制定将 在很大 程度上保 证科研 数据的可 靠性 、 一 致性 和 可重复 性 ， 对提 升我国 实验动物 科学自 主创新的 研究水 平， 进 而提高我国在实验动物领域的国际地位亦具有重要的科学意义。遗 传 质 量 控 制 是 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 标 准 化 的 重 要 组 成 部 分 ， 直 接 决定着 实 验结 果 的可重 复 性 、 稳 定 性 。 目 前国 内 使用的 实 验用 喜 马拉雅 旱 獭多 源 于青 海 、 新疆 的 野生型 ， 虽 然已 被 应用 于 人类 疾 病模型 的 建 立 ， 但 其遗传 背 景不 清 晰一

35、直 是 制约 喜 马拉5雅 旱獭 标 准化的 瓶 颈 。 国 内 有部分 关 于喜 马 拉雅旱 獭 遗传 背 景的 报 道 （ 国 外 未 见 报 道 ） ， 但 远 没 有 形 成 系 统 的 检 测 体 系 和 标 准 ， 而 关于 封 闭群的 喜 马拉 雅 旱獭相 关 标准 是 一片空 白 。 本研 究 以群 体 遗传 学 理论为 依 据 ， 在 汇集国 内 文献 资 料的基 础 上 ， 结 合当前 喜 马拉 雅 旱獭遗 传 质量 无 标准的 具 体国情 ， 重点围 绕 封闭 群 喜马 拉 雅旱 獭 ， 通过 微 卫星 位 点进行 筛 选 、 组 合与优 化 ， 建 立 了适用 于 封闭

36、 群 喜马拉 雅 旱獭 遗 传检测 的 方 法 ， 制 定了封 闭 群实 验 用喜 马 拉雅 旱 獭遗传 质 量标 准 。 本标准 经 过课 题 的系统 研 究并 广 泛地 征 求了 有 关专家 意 见 ， 为 封闭群 实 验 用 喜 马拉雅 旱 獭的 保 种 、 性 状 控制 和 生产管 理 提供 了 依 据 ， 对 促 进我 国 喜马拉 雅 旱獭 从 资源 优 势转 化 为科研 优 势和 商 品优 势 ， 实 现我 国 喜马拉 雅 旱獭 的 标准 化，对引导和规范行业发展都具有重要意义。三、主要起草过程2006 年 2010 年： 喜 马拉雅 旱獭人 工饲养 繁殖研究 ， 已 建立种群 2

37、00 只的人工饲养种群，2009 年人工饲养条件下旱獭 繁殖率达到 30%， 建 立 了 完 善 的 人 工 批 量 繁 殖 旱 獭 技 术 ； 2002 2006 年： 参 与 人类 乙肝动 物模型 喜马 拉雅旱獭 的研究 （国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 ， 武 汉 同 济 医 院 主 持 ） ， 证 实 喜 马 拉 雅 旱 獭 是 理想 的 人类乙肝 动 物模 型动物。 2006 年 2008 年 ： 喜马拉 雅 旱 獭人 工 感染嗜 肝 病 毒 （ WHV） 模 型 建立 研 究 (2006-J-Y14) （青 海 省 科 技 条 件 支 撑 项 目 ） ， 建 立 了 乙 肝

38、 模 型 的 基 本 方 法 和 技 术 ； 2009 年 2 011 年： 喜马 拉雅旱 獭人 类乙 肝 动物模型 标准化 研究6(2009-T-Y05) （青 海省科 技条件支 撑项目 ） ， 建立乙 肝动物 模型 的 标准化 ， 并且形成 了配合 饲料标准 的雏形 ； 2008 年 2 009 年 ： 新 药 美 他 卡 韦 对 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 线 粒 体 毒 性 的 评 价 （ 江 苏 长 澳 制 药 集 团 与 中 国 药 科 大 学 ） ， 证 实 喜 马 拉 雅 旱 獭 可 以 替 代 美 洲 旱 獭作为 我国抗乙 肝和艾 滋 病药物 的毒性 评价动物 ， 并为 “国

39、家 传 染病 防 治科技 重 大专 项 项 目 -乙 型 病毒 性 肝炎病 毒 感染 模 型 ”， 累 计提供 了试验用 人工饲 养旱 獭 200 余只， 配 合饲料 的使用 效果 得 到验证 ， 保证了 动物的 营养需求 和健康 ， 利用此 模型完 成了对 我 国 自 主 研 发 的 抗 乙 肝 一 类 新 药 美 他 卡 韦 （ Metacavir） 的 线 粒 体毒性的评价，且获得了 SFDA 的临床批件。2014 年 ， 随 着 （ 2014-TC-Y35） 喜 马 拉 雅 旱 獭 实 验 动 物 平 台 建 项 目 的实 施 ， 青 海央 宗 药业有 限 公司 积 累了有 关 科研

40、数 据 ， 集 成了 各 项技术 、 相关科 技成果和 知识产 权， 取得 了阶段 性重要 成 果 ， 通过 进一步开 展了喜 马拉雅旱 獭质 量 标准和技 术规范 研究 和 完 善 ， 并且结 合 我们查 阅的资料 和研究 结果， 形 成了本 标准研 究稿。2016年 10月 22日 ， 起 草 单 位 在 西 宁 召 开 的 课 题 进 展 讨 论 会 上 ， 就喜 马 拉雅旱 獭 的质 量 控制的 主 要标 准 包括微 生 物 、 寄 生 虫 、 遗 传 、 饲 料 、 环境等 及其饲 养技术规 范的讨 论稿进行 了汇报 和讨 论，得到了与会专家的肯定。2017年 年 2月 10日 ，

41、起 草 单 位 向 省 技 术 监 督 局 标 准 化 处 提 交 实验用 喜马拉雅 旱獭环 境与设施 、 实验 用喜马拉 雅旱獭 配合7饲 料 、 实验用 喜 马拉 雅 旱獭饲 养 管 理 、 实验 用 喜马 拉 雅旱獭 寄 生 虫 学 等 级 及 监 测 、 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 遗 传 质 量 控 制 、 实验用喜马拉雅旱獭微生物学及监测 的申请， 2017年 4月 10 日批准立项。2017年 8月 -12月 ， 起 草 单 位 将 本 标 准 申 报 稿 通 过 通 讯 的 方 式 ， 向 来 自 国 内 实 验 动 物 领 域 的 9位 知 名 专 家 征 求 了 意

42、 见 ， 共 收 到 31条 修 改意 见 ， 起 草小 组 对照反 馈 意见 进 行修 改 、 补 充和 完 善 ， 形成本标准。2018年 6月，根据青海省质量技术监督局组织的专家评审意 见 ， 建 立 谱系鉴 定 方 法 ， 即喜马 拉 雅旱 獭 遗传进 化 分析 方 法 （附 录 A） 。四、制定（修订）标准的原则和依据，与现行法律、法规、 标准的关系在 确定本 标准的各 项指标 时 ， 严格 遵循国 家科委颁 发的 实 验 动物 管 理条例 和国 家科委 与国家 技术监 督局联合 颁发的 实 验 动物 质 量管理办 法 ，同时 参考 GB 14923 2010实 验动物 哺 乳 类实

43、 验 动物的遗 传质量 控制 以及 迄今 为 止国内外 研究机 构所 有 发 表 的 类 以 喜 马 拉 雅 旱 獭 作 为 实 验 材 料 开 展 的 质 量 控 制 研 究 成 果 ， 最 终制定 实验用 喜马拉雅 旱獭 遗 传质量控 制 标 准。 本 标准编写格式符合 GB/T 1.1-2009 的 规 定 ， 编 制 遵 循 “科 学 性 、 实 用 性 、 统一性、 规范性 ”的原则 ， 有 利 于青海省 实验用 喜马拉 雅旱獭资源的有效利用，发挥特色资源的应用价值。8五、主要条款的说明本 标 准 规 定 了 实 验 用 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 遗 传 分 类 、 封 闭 群 的

44、 繁 殖方 法 、 遗传 质 量监 测 ， 适用 于 封闭 群 实验用 喜 马拉 雅 旱獭的 遗传质量控制和管理。1、喜马拉雅旱獭封闭群的定义、命名的确定 根 据 封 闭 群 的 遗 传 学 理 论 和 参 考 GB14923- 实 验 动 物 哺 乳类 实验动 物的遗传 质量控 制 制定 。 其中 规定封闭 群也称 远交群 动 物 ， 是 指以非近 亲交配 方式进行 繁殖生 产的实验 动物种 群 ， 在 不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖 4 代以上的群体。 同 样 ， 喜 马拉雅旱 獭封闭 群 ： 以非 近亲交 配方式进 行繁殖 生产的 实 验用喜 马拉雅旱 獭种群 ， 在不从 外部

45、引 入新个体 的条件 下 ， 至 少连续繁殖 4 代以上。喜 马拉雅 旱獭封闭 群的命 名 ： 封闭群 由 2 4 个大写 英文字 母 命 名 ， 种群名 称 前标 明 保持者 的 英文 缩 写名称 ， 第一 个 字母需 大 写 ， 后 面 的 字 母 小 写 ， 一 般 不 超 过 4 个 字 母 。 保 持 者 和 种 群 名称之间用冒号隔开。2、喜马拉雅旱獭封闭群繁殖方法的确定 原 则 是 保 持 封 闭 群 喜 马 拉 雅 旱 獭 的 遗 传 异 质 性 及 基 因 多 态性 ， 以 非 近亲交 配 方式 进 行繁 殖 ， 避免 近 交系数 随 繁殖 代 数增加 而 过快 上 升 。

46、作为 繁 殖用 种 子的封 闭 群喜 马 拉雅旱 獭 应遗 传 背景 明 确或 来 源清 楚 ， 有完 整 的资料 ， 包括 种 群名称 、 来源 、 遗传基 因 特 点 及 主 要 生 物 学 特 性 等 。 在 保 证 每 代 近 交 系 数 增 量 不 大 于91%的前提下，引种数量不得少于 25 对无血缘关系（三代以内无 共 同祖先 ） 的雌雄 喜马拉 雅旱獭。 封闭群 应足够大 ， 以保 持封闭 群实验喜马拉雅旱獭的遗传基因的稳定，并尽量避免近亲交配。 具体繁殖方法按照 GB14923-2010 中附录 B 执行。3、喜马拉雅旱獭封闭群遗传质量监测方法的确定3.1 微卫星标记法微 卫

47、 星 (Microsatellite) ， 又 称 简 单 序 列 重 复 (Simple sequence repeats, SSR)，是指以少数几个核苷酸（一般为 2 6 个 )为 重 复 单 位 组 成 的 简 单 多 次 串 联 重 复 序 列 。 微 卫 星 标 记 由 核 心序 列 和两侧 保 守的 侧 翼序列 构 成 ， 保 守 的侧翼 序 列使 微 卫星 特 异地 定 位于染 色 体某 一 区 域 ， 核 心 序列 重 复数的 差 异则 形 成微 卫 星的 高 度多态性 。 用微卫 星 DNA 侧 翼序 列 设计引物 进行 PCR 扩 增 ， 由 于 重复次 数 的不 同 形成

48、片 段 长度 不 同 ， 经 电 泳分 离 ， 凝胶 成 像表 现 出不同 的 电泳 带 型 。 由 于 微卫 星 具有丰 富 的多 态 性 、 位 点 数量 多 并且分 布 广 ， 检 测方法 简 便 、 快 速 、 稳 定 性好 和 结果可 靠 等优 点 ， 被认 为 是物 种 遗传多 样 性评 估 的最佳 分 子标 记 ， 已广 泛地应用于生物群体遗传特性的检测中。本标准推荐采用微卫星标记检测方法进行喜马拉雅旱獭封 闭 群的 遗 传检测。 应 用传统 的方法首 先提取 喜马拉雅 旱獭肌 肉组 织DNA，选取贺学等筛选的13个微卫星位点，设计合成引物，进 行PCR扩增。扩增产物经聚丙烯酰胺

49、凝胶电泳进行检测。各位点 等位基因数与原代（ F0）的分子量大小进行标准化比较后获得。10运用POP-GENE 32软件，计算群体各微卫星位点的基因频率、平 均观察等位基因数、平均有效等位基因数、Shannon指数、平均 有 效杂合 度等 。 群体 内遗传 变异采用 平均杂 合度指标 或群体 平衡 状 态方法 进行评价 。 当平 均杂合度 在 0.5 0.7时， 群体为 合格的 封闭群喜马拉雅旱獭群体。或用群体是否达到平衡状态来判定， 观 察和计 算群体各 微卫星 位点基因 频率 、 基 因型频率 的实际 值和 预 期值 ， 进行卡方 检验以 检测群体 是否达 到平衡状 态。 若 没有达 到 平衡状 态 ， 表明 群体的 基因频率 或基因 型频率发 生变化 ， 该封 闭群喜马拉雅旱獭群体判为不合格。3.1.1 抽样要求用于群体遗传分析的采样数量理论上是越多 越 准 确 ， 但考虑 实 际情 况 和可操 作 性 ， 要 求从每 个 封闭 群 中随机 抽 取非 同