1、蛋白聚糖 Agrin 与神经系统神经解剖学杂志(ChineseJournalofNeuroanatomy)蛋白聚糖 Agrin 与神经系统刘丙方王唯晰徐群渊(首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经修复重点实验室,北京 100054;西安交通大学医学院人体解剖学与组织学胚胎学教研室,西安 710061)神经系统的发育是一个极其复杂的过程,它包括形态的形成以及结构之间联系的建立.在这一过程中,细胞与细胞间的相互作用是一个关键因素.这种细胞间相互作用包括分化诱导作用与分化抑制作用,细胞外一些物质如细胞因子,粘附分子,激素及蛋白聚糖等都可介导细胞之间的相互作用,其中蛋白聚糖在发育中对于促进细胞间相
2、互联系起着重要的作用.蛋白聚糖分布广泛,并与神经系统的发育具有密切关系.Agrin 是神经系统中多种蛋白聚糖的一种.在 1983 年被Godfrey 从富含突触的电鳐 (Torpedo)电器官(electricorgan)的细胞外基质中发现一.开始认为它是一种细胞外基质蛋白,由运动神经元合成,沉积在神经肌肉接点(neuralmusclejunction,NMJ)部位,有促进突触后膜乙酰胆碱受体集聚的功能.后来有的学者发现,Agrin 不仅在 NMJ 表达,在中枢神经系统也有广泛分布,且在发育的不同阶段表达不同 l3.于是越来越多的学者对它在神经系统发育中的作用以及与一些神经系统疾病的发病关系产
3、生了兴趣.本文拟将近年来 Agrin 与神经系统发育以及在 Alzheimer 病中的作用做一综述.1.Agrin 是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)Agrin 开始被认为是细胞外基质蛋白.Tsen 等在 1995年,用抗 HSPG 的单克隆抗体 6D2,3A12 和多克隆抗血清免疫纯化一种 HSPG,其核心蛋白分子量为 250kD,整个分子量为 400kD,主要在鸡胚的脑中表达.通过对 6D2 的核心蛋白分子克隆,建立了一个 9d 的鸡胚 cDNA 文库,在这个文库中筛选出 12 条 cDNA 序列,发现与已经公布的鸡 AgrincD
4、NA 序列一致 ,从而证明 Agrin 是一种蛋白聚糖.Agrin 由多个结构域构成,这些结构域包括 9 个蛋白激酶抑制剂结构域,4 个表皮生长因子样结构域和 1 个粘附分子 G 同源结构域.2.Agrin 促进突触后膜乙酰胆碱受体的聚集Agrin 的主要生理特性是可促进突触后膜上的乙酰胆碱受体的聚集.Reist 等发现用抗 Agrin 的抗体可阻断肌肉表面的有神经纤维支配的乙酰胆碱受体的集聚;另外, 在神经细胞和肌细胞联合培养中形成的神经肌肉接点处可见乙酰胆碱受体与神经元轴突表面 Agrin 分子共同集聚.Agrin 的前体 mRNA(PremRNA)选择性剪接产生了一个同源蛋白(isofo
5、rm)家族 ,它的前体 mRNA 主要有两个剪接位点.这两个剪接位点主要位于 3 末端,在鸡类动物称为 A,B,所对应的核苷酸序列为 A(5016-5027),B(54235455)75,8;在哺乳动物称为 X,Y.在每个剪接位点,不同外显子的表达产生了不同的同源蛋白,它们具有不同的乙酰胆碱聚集活性.Agrinz 一(表示在 z 区有剪接片段的同源蛋白 )较Agrinz 一( 表示在 z 区无剪接片段的同源蛋白)的乙酰胆碱受体聚集活性高 1000 倍 l8.不同的同源蛋白分布于不同的组织.Agrinz 一主要由非神经组织如肌肉 ,胶质细胞,肝脏和肾等产生,Agrinz 则主要由神经元产生 .在
6、中枢神经系统(CNS),Agrinz 一占 Agrin 总量的 90,而 Agrinz 一只占10.其中在大脑感觉皮层,Agrinz 的含量达到 96,Agrinz 几乎无表达1.所以,缺少 Agrinz 的同源蛋白的突变鼠在胚胎末期或生后立即死亡,并失去了突触前和突触后分化的能力.3.Agrin 在神经系统广泛分布并在发育期有不同表达开始认为 Agrin 仅分布在神经肌肉接头处,由运动神经元(/JE 碱能神经元) 合成,通过轴突运输到达 NMJj.后来有的学者用原位杂交方法证明 Agrin 不仅在运动神经元而在整个神经系统都有分布】.Cohen 等用免疫组化方法研究了 Agrin 在成年大鼠
7、神经系统的分布.用两种能包含所有同源蛋白的多克隆抗体发现 Agrin 在脑内广泛分布,主要在大脑皮质,小脑和脑干神经核.阳性产物主要集中在神经元的胞体以及与胞体相连的近段突起上.同时,Agrin 的免疫反应阳性产物不仅存在于胆碱能神经元,在多种类型的神经元都有表达.通信作者:徐群渊地址:首都医科大学北京神经科学研究所,北京 100054,电话:01065031103,Email:212 神经解剖学杂志第 19 卷第 2 期 2003 年 6 月Agrin 不仅分布广泛且其表达随发育而发生变化.其不同同源蛋白在不同脑区也有不同的表达高峰.Ii 等“用PCR 方法检测小鼠的 Agrin 在大脑感觉
8、皮层分布,发现生后1d,Agrin 的 mRNA 水平很低,在生后 23d 达到高峰 ,且一直持续到 1 周左右,第 2 周开始下降,至第 3 周已达到成年鼠的水平.而脑内大部分神经纤维也是在生后 23d 形成突触的,如丘脑的感觉纤维就是在此期间进入大脑的感觉皮层与大脑的神经元形成突触一.Ii 等同时发现不同的同源蛋白的表达高峰不同,有的 Agrin 的同源蛋白在生后 3 周方达到高峰,还有一些同源蛋白在成年鼠脑中表达较高.1997 年,Halfter 等在 4d 的鸡胚(E4) 发现 Agrin 阳性产物存在于脊髓,以软脊膜分布为最多.在 E5E10,Agrin 在脊髓白质的分布逐渐增多,从
9、 E13 开始,Agrin 的免疫反应阳性物质减少,最后仅限于软脊膜和血管,而在鸡胚的发育全过程中,Agrin 在脊髓前角,即脊髓的运动神经元未发现表达.但 Ma 等一一却发现 Agrin 的免疫反应阳性产物主要存在于前角运动神经元以及脊髓中央管周围,所以,一些学者对 Agrin 在脊髓的分布报道很不一致.周围神经纤维也有Agrin 分布 ,近年研究较多的是视神经.上述的 Halfter 等在鸡胚 E4 即发现 Agrin 免疫反应阳性物质存在于视网膜的基底层和视神经以及视神经周围的软膜上.通过电镜观察,发现视神经周围的免疫阳性物质存在于视神经轴突的表面,与laminin 一 1,neuroi
10、lament 以及 merosin 共存,这些都属于糖蛋白家族.Agrin 还存在于脊神经节以及感觉神经,但Halter 却认为在周围神经的 Agrin 不是分布在轴突上,而是存在于轴突周围的 Schwann 细胞的基底膜上.4.Agrin 在神经肌肉接头处的受体Agrin 可引起神经肌肉接点 AChR 的聚集.在 NMJ 处,AChR 的浓度为 110pmol/I,用化学方法得到 Agrin 浓度为 AChR 浓度的 1/501/100“,提示至少有一种扩大机制存在于 Agrin 的信号通路上,而酪氨酸磷酸化可能起到这样的作用.Agrin 可刺激 AChR 的 S 亚单位酪氨酸磷酸化,用酪氦
11、酸激酶抑制剂(staurosporine) 可阻滞 Agrin 产生的 AChR聚集.所以,Agrin 在 NMJ 的作用方式,可能是通过受体与配体结合.经一系列信息传递反应,逐级放大,引发相应的生物学效应.所以,识别 Agrin 受体是阐明 Agrin 信号传导通路的关键.Dystroglycan 是否为 Agrin 的受体?Nastuk 等一利用配体结合技术,在 Torpedo 的电器官的突触后膜和培养的肌管上首先确认出能够与 Agrin 结合的一种物质,认为是Agrin 的受体;Agrin 与其结合呈饱和状态 ,而且具有很高的亲和性.这种结合需要细胞外钙离子的参与.在 Agrin 的刺激
12、下,这种物质与 AChR 共同积聚 ,后来发现,是两种膜蛋白复合体,分子量分别是 19000 和 50000 一“一.对这两种膜蛋白分析,证明它们分别是 aDystroglycan 和口一 Dystroglycan.以前认为这两种物质是与糖蛋白有关的肌营养不良素(Dystrophin),主要分布在肌细胞的表面及神经元的周围基质.a1)ystroglycan 以一种钙依赖的方式与 Agrin 结合;SDystrophin 则是一种跨膜糖蛋白.aDystroglycan 一端与 Agrin结合,另一端可以和 SDystroglycan 连接,而 Dystroglycan在细胞内与 dystroph
13、in 或 utrophin 相连,引起一系列级联反应.aDystroglycan 是目前发现的唯一能与 Agrin 结合的物质.而 aDystroglycan 与 Agrin 的结合对于 Agrin 引导突触的分化可能具有十分重要的意义一.关于 Agrin 与 I)ystroglycan 的关系可用下图表示:上图显示:Dystrophin 相关蛋白复合体跨肌纤维膜,通过基底膜与膜下的细胞骨架相连,这种模式包括几个蛋白dystrophin,utrophin,aSDystroglycan,syntrophin 和分子量为 50000(adhalin),35000,25000 的多肽.细胞外的蛋白多
14、糖aDystroglycan 的一端在细胞外基质与 Agrin 连接,另一端与 SDystroglycan 紧密连接 ,细胞外骨架蛋白 dystrophin 和utrophin 通过 pDystroglycan 在(一末端连接在质膜上.actine肌动蛋白通过其氨基末端与 dystrophin 连接在一起 (引自参考文献2O)关于 I)ystroglycan 是否直接对 AChR 发生作用?还缺乏研究,所以 Dystroglycan 是否为 Agrin 的受体还值得怀疑.有二个实验采用同一种抗体阻滞 Agrin 与 Dystroglycan 结合.抑制 Agrin 与 AChR 集聚活性,结果
15、却相互矛盾 ,分别是完全抑制,部分抑制:和无抑制作用一“一.近年来的一些实刘丙方等:蛋白聚糖 Agrin 与神经系统 213验也不支持 Dystroglycan 是 Agrin 受体的说法.Heathcote等在 Xeropus 的受精卵注入过量的 DystroglycanmRNA,并用罗丹明一 a 银环蛇毒标记 ,结果发现 Dystroglycan 过度表达不但未增加反而减少了 AChR 的集聚.其原因可能是 Agrin 含有两个结构域,分别与 Dystroglycan 和调节 AChR 集聚的分子结合,Dystroglycan 的过度表达,竞争抑制了 Agrin参与 AChR 集聚的信号系
16、统.是否存在 AgrinMUSCMuSK 信号系统?Wallace 等 l1在培养的肌细胞中加人 Agrin,30min 后可观察到 AChR 的p 亚单位的磷酸化增加,如果阻断 Agrin 所引起的 AChRB亚单位磷酸化,则会使 AChR 集聚能力丧失.这说明 AChR受体的集聚是通过 Agrin 作用使其自身口亚单位酪氨酸磷酸化来实现的,用酪氨酸激酶抑制剂 staurosporine 可阻断Agrin 产生的 AChR 口亚单位酪氨酸磷酸化,从而阻断AChR 的积聚 ,更说明口亚单位酪氨酸磷酸化在 AChR 集聚过程中起作用_2.Wallace 认为 Agrin 能激活酪氨酸蛋白激酶,加
17、强 AChR 与细胞骨架间的相互作用 ,所以有利于AChR 的集聚并得到稳定.故可以推测,Agrin 所作用的受体可能是含有酪氨酸激酶的,Agrin 与这种受体结合时激活酪氨酸蛋白激酶,引起细胞内信号的传递反应.这种酪氨酸激酶受体为骨骼肌所特有,于 1995 年由 Valenzuela 等分离,命名为肌肉特异激酶(musclespecifickinase,MuSK).MusK 主要在发育中的肌细胞表达,随着发育的成熟 ,表达也逐渐降低.如果干扰 MuSK 的基因编码,则 NMJ 不能形成,也不能形成 AChR 及其他突触后蛋白的集聚 2.与其他突触成分相比,MuSK 在突触的分布较少 .所以,
18、在整个 Agrin 信号转导过程中,MuSK 可能具有级联放大作用,激活一系列酶促反应,从而使 AChR 发生积聚.由于 Agrin 本身没有与 MuSK 结合的细胞外结构域 ,所以可能存在另一种尚未被识别的,并与肌管相关的特殊成份(myotubeassociatedspecificcomponent,MASC)连结,即由 MASC 充当Agrin 的受体.MASC 还未被证明 ,有人认为 MASC 可能就是 Dystroglycan,包括 aDystroglycan 和 Dystroglycan.这是因为 Agrin 有与 Dystroglycan 连结的结构域.但如前所述Dystrogly
19、can 能否引起 AChR 集聚,很多学者的报道尚不一致.Rapsyn 是一种 43kD 的膜相关蛋白,与 AChR 以 1:1的比例共存,也分布于发育早期阶段的突触_2.Apel 等发现缺少 Rapsyn 的突变鼠,尽管 AChR 在突触形成的早期阶段基因表达正常,但不能形成集聚.Gautam 等“ 在 MuSK缺乏的突变肌细胞中加人一种已经确认的乙酰胆碱受体积聚因子 VVAB4,仍然可以看到 AChR 的积聚,但把 VVAB4 加人 Rapsyn 缺乏的突变肌细胞中,却不能形成 AChR 的积聚.所以 Rapsyn 是积聚的必要成分,但没有直接的证据表明 Rapsyn 是 MASC.因此识
20、别 MASC 则为目前研究 Agrin作用机制的一个重要领域.5.Agrin 对 CNS 发育具有重要作用Agrin 是否能够促进突触的发育?Agrin 在 CNS 广泛分布而且在各种神经元中有表达,但其在 CNS 的功能还未阐明.由于 Agrin 在 NMJ 的发育过程中能够促进突触后膜的AChR 积聚,而 CNS 神经递质的受体也集中在突触后膜,因而使人联想到 Agrin 在 CNS 神经元与神经元之间也有相似的作用.但 Li 等在用 AgrinZ 缺乏的突变鼠观察脑内受体的分布时,却发现抑制性甘氨酸受体和 GABA 受体以及兴奋性谷氨酸受体 NMDA 和 AMPA 均发生了积聚,而且突触
21、成分 SV2,synaptophysin 及 Synapsin 的含量与对照组没有区别.所以,似乎 Agrin 并非为突触分化所必须.也可能存在着其他与突触分化有关的物质;也可能是 AgrinZ 对于CNS 突触的分化有至关重要的作用.但 Agrinz 主要由胶质细胞分泌.Burgess 等.用 Agrin 完全缺乏的突变鼠也未发现神经元发育受限.Ferreira_3 发现 Agrin 表达在培养的海马神经元突触形成之前增加,并伴随有 Agrin 在轴突远端的沉积.而用抗 Agrin 的寡核苷酸处理后,发现海马神经元树突发育受到损害,突触形成明显减少,并且观察到 GABA 受体的积聚减少.Ma
22、ntych 等_3 发现 Agrin 可调节轴突和树突的生长,即抑制轴突主干的伸长,促使分支形成;既能增加树突的长度也增加树突的分支,从而有利于突触的形成.所以,尽管 Agrin 在 CNS 不是受体积聚所必需,但对于突触的发育却具有重要的作用.Agrin 与细胞粘附分子(celladhesionmolecule,CAM)的关系 Halfter 等发现在轴突上有大量的 Agrin 表达,并主要分布在其表面,提示 Agrin 可能对轴突生长有重要作用.Halfter_3 又证明,Agrin 在眼玻璃体与层粘连蛋白的 fibronectin 和其他几种未识别的蛋白共存.由于 Agrin 本身是一种
23、含有硫酸乙酰肝素的蛋白聚糖,在结构上允许与含有肝素连接位点的分子发生结合,而这些分子多是分布在细胞外基质的粘附分子,本身都含有肝素的连接位点,如laminin 一 1,fibronectin,neurotropic 和 netrins 等 aT.而laminin 一 1 和 fibronectin 在离体实验已被证明有促进轴突增长的作用.所以,Agrin 在轴突表面分布并能与这些粘附分子结合,可能具有使 laminin 一 1 和 fibronectin 积聚到轴突表面的作用.识别 Agrin 在 CNS 的受体是研究 Agrin 特性的重要一步.1999 年,Hilgenberg 等在培养海
24、马神经元和皮质神经元中发现,Agrin 可使即刻早期基因 clos 表达增加,且这种表达与 Agrin 的浓度有关.所有 Agrin 的同源蛋白都可以引起 flos 表达.Ji 等发现,Agrin 能引起海马神经元的cAMP 应答元件(cAMPresponseelement,CRE)结合蛋白(CREB)的磷酸化.CRE 是 cAMP 反映元件,这说明 CREB在 Agrin 的信号传导过程中起了一定作用.CREB 主要介导cAMP 对基因表达的影响,与 DNA 启动子区的 CRE 的特殊序列相结合,而影响基因转录.神经系统内表达 TH,pzAR,flos,前脑啡肽,SOM 和 VIP 等的基因
25、都含有 CRE.这些基因的表达可通过与磷酸化的 CREB 和 CRE 结合而调节.可与 CRE 结合的蛋白很多,只有 CREB 被证明有介导 cAMP的作用;引起细胞内 CREB 活性增高的外来信号大都是激活214 神经解剖学杂志第 l9 卷第 2 期 2003 年 6 月蛋白激酶 A(cAMPdependentproteinkinase.PKA)的途径.PKA 使 CREB 磷酸化. 只有磷酸化的 CREB 才具有转录活性.当外来刺激导致细胞内 cAMP 水平增高时.CREB 被磷酸化方能激活.Agrin 可引起 CREB 的磷酸化.也可能是通过激活依赖 cAMP 的蛋白激酶 A 来实现的.
26、这说明 Agrin的表达可能是通过一种细胞表面受体引发信号传导通路的结果.Agrin 与该受体结合后,可通过 G 蛋白的介导,或激活受体本身含有的内在酶的活性,引起细胞内第二信使 cAMP水平增高.从而激活依赖 cAMP 的 PKA.产生一系列的生物学效应.而这种传导通路依赖细胞内钙离子的作用.“.尽管 Agrin 在 CNS 也可能通过一种信号传导系统发挥作用,但究竟那一种物质是 Agrin 的受体呢?已知 Dystroglycan 在 NMJ 是一种与 Agrin 结合的膜蛋白,尽管对其参与乙酰胆碱受体的积聚表示怀疑,但 Dystroglycan 在脑中广泛表达;Agrin 引起 cfos
27、 表达也提示 Dystroglycan 在 CNS 充当 Agrin 受体的可能性,但仍有几个问题不支持 Dystroglycan 作为 Agrin 受体的观点 .首先,原位杂交的方法证明 Dystroglycan 的 mRNA 在皮质表达很低: 其次,肝素不能阻止Agrinz 与 Dystroglycan 结合,却可以抑制 Agrinz 对 c 一_厂 0s的表达 L41j.Agrin 在 NMJ 产生的 AChR 积聚作用的关键一步是跨膜酪氨酸激酶的快速磷酸化.在 CNS,激活 Agrin 受体所需Agrin 的浓度与激活 MuSK 磷酸化及 AChR 积聚的浓度相同.而 Agrin 在皮
28、质神经元引起 cfos 的表达也非常快,并能被蛋白激酶受体阻滞剂 staurosporine 阻滞.尽管有这些相似之处,但目前还没有在发育成熟的脑中发现 MuSK 的表达;同时,尽管肝素可以抑制 Fos 的表达.但却不能抑制Agrin 产生的 MuSK 磷酸化;第三,仅仅具有乙酰胆碱积聚活性的 Agrin 能导致 MuSK 的磷酸化,而所有 Agrin的同源蛋白都能影响 Fos 的表达,神经元中 Agrin 的受体也可以被所有 Agrin 的同源蛋白所激活.所以,不能确定MusK 在 cNs 充当 Agrin 的受体.Agrin 致 c 一_厂 0 表达增加的作用可以被一种能穿透膜的钙鳌合剂 BAPTA.AM 阻滞,提示细胞内钙是 Agrin 信号转导的一个重要因素.其未知受体的激活也需要细胞外钙离子 m.细胞内钙离子的短暂增加也可以调节肌肉中 Agrin 产生的 AChR 的积聚 .但 Agrin 在 CNS 有否与肌肉的信号
