1、siRNA 沉默人类血红素敏感基因 1 对膀胱癌 T24 细胞的影响汤磊 1 李瑞晓 于垂恭 袁建林 武国军 #汤磊：第四军医大学，西京医院泌尿外科，硕士研究生，710032，email：李瑞晓：第四军医大学，西京医院泌尿外科，硕士研究生，710032于垂恭：第四军医大学，西京医院泌尿外科，博士研究生，710032袁建林：第四军医大学，西京医院泌尿外科，医学博士，科室主任，博士生导师，710032武国军：第四军医大学，西京医院泌尿外科，医学博士，科室副主任，硕士生导师，710032 email：siRNA 沉默人类血红素敏感基因 1 对膀胱癌 T24 细胞的影响汤磊 1 李瑞晓 于垂恭 袁建林
2、 武国军 #1 第四军医大学西京医院泌尿外科， 710032 ()# 第四军医大学西京医院泌尿外科， 710032（ ）摘 要 目 的 观察人类血红素敏感基因 1（ HRG-1）基因在膀胱正常组织和膀胱肿瘤组织中的表达情况，通过 RNA 干扰技术抑制 HRG-1 在膀胱癌 T24 细胞表达水平，观察生长增殖的变化。方 法 应用免疫组化 SP 法检测 85 例膀胱肿瘤（膀胱乳头状瘤 25，低级别膀胱癌 30，高级别膀胱癌 30）和 20 例膀胱正常组织石蜡标本中 HRG-1 表达情况，并进行相关临床病理分析。设计针对 HRG-1 基因的 siRNA，转染膀胱癌 T24 细胞，应用免疫印迹法和 R
3、T-PCR 分析 HRG-1 siRNA 的表达，MTT 和流式细胞术（ FCM）检测增殖凋亡的变化。 结 果 正常膀胱组织和膀胱癌组织中 HRG-1 表达有显著性差异(P80%为+。选取具有代表性视野采集图片。1.4 细胞培养 人膀胱癌细胞株 T24、5637、BIU-87 及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1 均购买于中国科学院上海细胞库。膀胱癌细胞株 T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮细胞 SV-HUC-11 常规复苏后，在 10%胎牛血清的 1640 培养液中培养，培养条件：在 5%二氧化碳浓度、饱和湿度及 37下进行。1.5 蛋白印迹检测(Western-blot) 蛋白裂
4、解液提取细胞总蛋白。按 BCA 法进行总蛋白定量，取 5ug 蛋白质总量样品进行 120g/L 的 SDS-PAGE 凝胶电泳后将凝胶转移到硝酸纤维膜(NC)膜上，丽春红染色观察转膜的效果，标记 Marker 的位置。5%脱脂牛奶室温封闭 1h，鼠抗人 HRG-1 单克隆一抗、鼠抗人 GAPDH 多克隆一抗室温孵育 1h，4过夜，选用荧光素标记的兔抗鼠二抗，室温孵育 1h，然后使用计算机-荧光扫描仪系统对膜进行扫描，保存结果留待分析。1.6 siRNA 分析 T24 细胞常规接种于 6 孔板，用不含双抗的培养液培养，细胞长满 60-80%后，通过脂质体 Lipofectamine2000(In
5、vitrogen,Carlsbad,CA)转染 siRNA 于 T24 细胞。siRNA-HRG-1（NM-017842），HRG-1-siRNA 序列为：5-GUGGUCUCCCAGGAAGCUGUdTdT-3 ,5-ACAGCUUCCUGGGAGACCACdTdT-3，Control-siRNA 序列为：5- UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3,反义链为 5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。操作严格按照产品说明书操作。37孵育6h 后，跟换培养液，继续孵育。通过 RCR 和 western 检测 HRG-1 基因沉默水平。1.7 反转录 PCR 分析 胰
6、酶消化收集对数生长期的细胞，每 1107细胞加1mlTrizol 裂解液(TaKaRa 公司)，其余步骤严格按产品说明书操作，提取的总RNA 经紫外分光光度计定量后，逆转录成 cDNA。逆转录产物用于聚合酶链反应(PCR)，引物合成与北京奥科公司合作完成， HRG-1 引物序列为：5- ATGCCCACCGCTACCGGGCT -3。5 - CTACACCTTGACCTCTTGAC -3，理论扩增长度360bp，GAPDH 引物序列为：5-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 ，5-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3。反应条件如下：HRG-1 循环参数为 95变性5min，9
7、530S、5930S、7230S(35 个循环)，727min；GADPH 循环参数为95变性 5min，9530S，5730S，7230s(30 个循环),727min。各取30ulPCR 反应液在 10g/L 琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭(EB)染色后照相。Kodak Digital Science ID 软件系统扫描。1.8 增殖凋亡检测 MTT:收集对数生长期的细胞，包括 siRNA 处理的 T24 细胞（转染 24h 后），以 1104/ml 接种于 96 孔板中，每孔加入 200ul，每板接种6 个复孔，1640 培养基培养。12h 后选择一块，每孔加入 20ul（5mg/ml
8、）MTT试剂。37 C 孵育 4h，弃上清，每孔加入 150ulDMSO，震荡 10min，490nm 波长测吸光度值，取平均值；以后每隔 12h，取出一块板，重复上述操作。FCM:将 T24 细胞以 5105接种于 6 孔板中，siRNA 处理 24,48h 后，收获细胞转移至离心管，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，无水乙醇固定，并设空白对照。然后用350ul 结合缓冲液重悬细胞，每组处理细胞分别加入 10ul 碘化丙锭(PI)和凋亡检测试剂 5ul AnnexinV-FITC(Bipec 公司)，4下避光染色 15min，上机检测。细胞周期凋亡分析采用美国 BectonDiekinson 公司
9、的 CellQuitPlot 分析软件分析细胞增殖和凋亡的变化。1.9 统计学处理 采用 SPSS170 统计软件分析，采用了卡方检验、单因素方差分析及多样本两两比较采用 SNK-q 检验,以 p0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 HRG-1 基因在膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织中的表达HRG-1 的阳性反应物质主要在胞浆内。HRG-1 在膀胱正常组织中的阳性表达率为 25(5/20) ，而在膀胱肿瘤组织中的阳性表达率为 71.8( 61/85)，两组表达率差异有统计学意义(X 2=15.166， P0.05年龄60岁 11 3 4 11 1060岁 13 4 7 9 13-0.014
10、p0.05病理分级乳头状瘤 14 1 2 4 4 0.38 P0.01低级别癌高级别癌 82244 65 10 712采用 spss17.0 统计软件，Pearson 相关性检验。图 1 HRG-1 基因在正常膀胱组织和膀胱肿瘤组织中的表达情况。1 为正常膀胱组织；2 为膀胱乳头状瘤组织；3 为低级别膀胱癌组织；4 为高级别膀胱癌组织。可见 HRG-1 的阳性表达率随着恶性程度增高而增高。图 2 为不同膀胱癌的 HRG-1 蛋白表达水平。*p0.01。图 3 Western 和 RT-PCR 检测,HRG-1-siRNA 能下调 HRG-1 蛋白和 mRNA 的表达。 A 为 mRNA 检测，B 为蛋白检测。*p0.01.图 4 细胞生长增殖曲线检测 T24 细胞株经 HRG-1-siRNA 处理后，HRG-1-siRNA组细胞增殖较其他两组受到明显抑制。*p0.01。图 5 各组 T24 细胞株在 24h 和 48h 凋亡情况。1-3 为 24h，4-6 为 48h。(1、4)为空白组；（2、5）为 Control-siRNA 组；（3、6）为 HRG-1-siRNA 组。可见，HRG-1-siRNA组凋亡比例较其他两组明显增加。
