1、肢体缺血大鼠骨髓内皮祖细胞的动员与组织血管新生的相关性研究December2004,Vol21,No.1221 卷第 12肢体缺血大鼠骨髓内皮祖细胞的动员与组织血管新生的相关性研究张喜成何延政李跃武刘勇陈一尘【摘要】目的探讨肢体缺血因素对骨髓内皮祖细胞(EPC)的动员及肢体血管新生的影响.方法切除,结扎单侧股总,股浅动脉建立大鼠后肢缺血模型,另设对照组.1 周后通过细胞培养,观察外周血 EPC 数量的变化,4 周后检测缺血组织微血管密度(MVD) 及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况.结果实验组外周血 EPC(48.67.5)个/mm 较对照组(23.14.3)个 /mm2 明显增加(P0
2、.01);组织 MVD(224.845.87)n/mm2 显着高于对照组(136.304.52)n/mm2(P0.01);实验组缺血组织 VEGF 表达明显增强(吸光度值 A:0.1620.018),对照组仅少量表达(A:0.0550.006); 外周血 EPC 与组织 MVD,VEGF 吸光度之间有非常显着相关(P0.01).结论肢体缺血通过动员骨髓 EPC,促进缺血组织的新血管生成,改善局部供血,达到部分代偿目的.【关键词 l 缺血;内皮祖细胞;血管新生;微血管密度Mobilizationofbonereal-rowderived-endothelialprogenitorcelIsrel
3、atedtoneovascularizationinratis-chemicmodelzHANGxicheng.LIYuo=.CHENYicheng.eta1.DepartmentofGeneralSurgery,theSecondPeoplesHospimlofHuaian,Huaian223002,China【Abstract】0bjectiveToexploretheeffeCtoflimbischemiaonmobilizationofbonemarrowderivedendothealprogenitorcells(EPCs)andneovascularizationofischem
4、ictissue.MethodsUnilateralischemicmodelofthehindlimbsWaSproducedbyexcisionofthecommonandsuperficialfemoralarteryin20malerats.Theother20animalsservedasthecontrolgroup.Atweek1afteroperation.thechangeofthecirculatingEPcsWaSobservedbymononuclearcellsculture.MicrovesseldensityandtheVEGFexpressionofischem
5、iclimbsWaSdetectedatweek4.ResultsThenumberofcirculatingEPCsinexperimentgroupWaSsignificantlyincreasedascomparedwiththecontrolgroup(48.67.5/mm2VS23.14.3/m,PO.01).MicrovesseldensityofischemiclimbsWaSsignificantlyhigherthanthatincontrolgroup(224.845.87/mmvs136.3O4.52/mm,P0.01).TheVEGFexpressioninexperi
6、mentgroupWaSsignificantlyhigherthanthatincontrolgroup(A:0.1620.018VS0.0550.006,PO.01).ThenumberofcirculatingEPCsWaSgreatlyrelatedtOthemicrovesseldensityandVEGFexpression(PO.01).ConclusionLimbischemiacanaugmentlocalperfusionbyimprovingneovascularizationwithEPCsmobilization.【Keywords】 Ischemicmodel;En
7、dothellalprogenitorcells;Neovascularization;Micmvesseldensity内皮祖细胞(EPC)是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞,可直接参与血管发育和生成 l_.我们以肢体缺血大鼠为研究对象,观察外周血 EPC 及缺血部位血管新生情况,探讨缺血因素对成年体骨髓(EPC)的动员和组织血管新生的影响.材料和方法1.动物模型的建立:健康成年雄性 SD 大鼠 40只,体重 140150g.随机分实验组,对照组各 20 只,氯胺酮麻醉后,实验组结扎切除单侧股总动脉,股浅动脉.对照组仅作皮肤切开缝合.1 周后彩超检查确定作者单位:223002 江苏省淮
8、安市第二人民医院普通外科 (张喜成,陈一尘).病理科( 李跃武);四川省泸州医学院附属医院血管外科(何延政,刘勇)?1537?实验研究?动脉缺血模型建立成功,继续饲养 1 周.2.EPC 培养及鉴定 :动物模型建立 2 周后,两组各取 10 只,无菌心脏采血 3ml,肝素抗凝,生理盐水1:1 稀释,用动物单核细胞分离液(Nycoprepm1.077A,AxisShield 公司)3ml,密度梯度离心法分离获单个核细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,制成细胞悬液.以细胞浓度 110 个接种于多聚赖氨酸处理后的 24 孔培养板,培养液为含 15%胎牛血清的 1:1DMEMIMDM(美国 Gibco
9、公司).37,5%CO,孵箱培养 2d 后更换培养液,弃悬浮细胞.再培养 2d 后洗去未贴壁细胞,95%冷乙醇固定,PBS 漂洗,滴加一抗:兔抗鼠 CD34 多抗(1:200,美国 SantaCruz 公司).阴性对照以 PBS 代替一抗 ,湿盒内 4冰箱过夜.PBS 振洗 ,加异硫氰酸标记的二抗 50l(FITC-IgG,武:2004 年 12 月第 21 卷第 12 期 ChinJExpSurg,December200,ol2Q.2汉博士德公司),湿盒 37孵育 1h,PBS 洗涤后立即荧光显微镜下观察,摄片.换上带标尺的目镜,高倍镜下(HPF,200 倍 )随机选 5 个视野,作 CD3
10、4 阳性细胞计数.3.MVD 和血管内皮细胞生长因子(vEGF)检测:术后 4 周处死剩余大鼠,取术侧内收肌组织块,4%多聚甲醛溶液(pH=7.4) 固定 24h,石蜡包埋,制成厚 5肚 m 切片.依据链霉抗生物素蛋白.生物素.过氧化物酶复合物(sABC)进行免疫组织化学反应,一抗分别为免抗鼠 VwF 因子(1:200,美国 SantaCruz 公司), 免抗鼠 VEGF 多抗(1:150,武汉博士德公司),二抗为即用型 SABC 试剂盒(武汉博士德公司),依说明书操作.阴性对照以 PBS 代替一抗 .结果判断:胞浆呈棕黄染色者为内皮细胞(EC)vwF 因子表达阳性,以 1 个棕黄染色 EC
11、或细胞丛为1 个微血管,结构不相连的分支结构也可作为 1 个血管,染色模糊分辨不清或管腔大于 8 个红细胞大小,带肌层的血管不予记数.先低倍视野观察血管密度最高处,再以带标尺的目镜 200 倍下随机选 5 个视野,记录微血管数目.2 名观察者采用双盲法对同一切片记数,取两者的平均值为该片 MVD.VEGF 免疫组织化学结果采用计算机图象扫描系统(Q550IW, 德国 Leica公司),计算 VEGF 的吸光度值(A).4.统计学方法:采用 SPSS 统计软件,数据采用均数标准差(S)表示,应用 t 检验,Spearman 非参数秩和相关性检验.结果1.大体观察:动物均存活,实验组术后均出现不同
12、程度的肢体跛行,1 周后渐消失.10d 后患侧肢端毛发脱落稀疏,毛皮发亮,5 只出现趾端肿胀,坏疽,趾甲缺损脱落,1014d 后坏疽脱落,创面愈合.对照组无肢体缺血表现.2.EPC 的培养鉴定 (图 1):单个核细胞接种 5h后,部分细胞开始贴壁,早期贴壁细胞呈小球形,仅少数细胞伸展,2d 后开始逐渐伸长变型,呈纺锤型,两端有突起伸出,核清晰呈圆形或卵圆形.4d 内纺锤型细胞未见分裂相.CD34 荧光染色呈黄绿色强荧光.实验组阳性细胞数(48.67.5)个/mm2 显着高于对照组(23.1 4.3)个 mm,(P0.01).3.组织 MVD 和 VEGF 表达(图 24):实验组见新生微血管点
13、状分布于肌细胞间,管壁被覆 1 到数个棕黄色染的 EC,MVD 为(224.845.87)n/mm2,对照组肌细胞间微血管少,MVD 为(136.304.52)n/mm2,两组相比差异有统计学意义(P0.01).实验组局部组织 VEGF 表达明显升高(A:0.1620.018),棕黄色颗粒呈带状分布于骨骼肌胞浆内,而对照组呈阴性或弱阳性表达(A:0.0550.006),两者差异有统计学意义(P0.01).相关性统计检验显示,外周血EPC 数量与组织 MVD,VEGF 吸光度之间均差异有统计学意义(P0.01).讨论EPC 最初发现在胚胎期参与胎儿的血管发育,近年发现成年体内也存在 EPC,主要
14、分布于骨髓,外周血含量极少,且同样可参与后天性的血管新生.2J,在缺血,创伤等因素或某些因子动员下,骨髓 EPC 释放至外周血,定向迁移至缺血部位,增殖分化为血管 EC,参与局部血管新生 J.VEGF,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的促血管生成作用,其实质就是动员骨髓 EPC 的迁移 ,增殖,分化,而发挥血管新生效应3,引 .实验结果显示,肢体缺血大鼠外周血 EPC 增多,组织 VEGF 表达上调,MVD 明显增加,且外周血 EPC与 VEGF 表达,组织 MVD 之间相关性非常显着,表明缺血肢体代偿性的血管新生,是通过动员 EPC 的迁移分化而发挥作用.其机制可能为缺血因素导致外周血和
15、组织 VEGF 表达上调,进而动员骨髓 EPC 释放,趋化至缺血部位增殖,分化为 EC.这些 EPCs 和 ECs 又通过旁分泌或自分泌产生多种血管生长因子,进一步促进表皮细胞,EC 再生和分裂并形成管状结构,产生正反馈的促血管新生效应,改善组织供血.缺血因素自发性动员 EPC,促进血管新生,力图改善组织供血的代偿作用毕竟有限,仍需投入外源性的治疗措施.本实验仅研究缺血机体 EPC 的自我动员与组织血管新生的相关性,初步探讨肢体缺血的代偿机制,对 EPC 定向迁移,分化及参与血管新生的具体机制,EPC 的动态变化规律仍需深入研究,为临床治疗的最佳方案,时机提供实验依据.(本文图 l4 见插图
16、l24)参考文献1A5aharaT,MuroharaT,SullivanA,eta1.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science,1997,275:964967.2AsaharaT,TakahashiT,MasudaH.eta1.VEGFcontributestopostnatalneovascularizationbymobilizingbonemarrowderivedendothelialprogenitorceNs.EMBoJVol,1999,18:39643972.3TakahashiT.KalkaC,MasudaH.eta1.Ischemia.andcytokine.inducedmobilizationofbonemarrowderivedendothelialprogenitorceHsforneo.vaseularization.NatMed.1999.5:434438.4 张喜成,何延政.骨髓细胞移植治疗肢体缺血的研究进展.中华实验外科杂志.2004.21:121122.(收稿日期:200311-25)
