1、免疫印迹技术的基础-免疫反应,免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性,Western Blot原理简介Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,内容概要,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot 原理,目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析,Western Blot 的应用,Western Blot原理简介Western Blot一般流程Wes
2、tern Blot常见问题分析,内容概要,蛋白样品的定量,Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品Bradford蛋白质定量试剂盒,不连续的电泳缓冲体系。SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,N,N-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝
3、胶浓度与蛋白分离范围,转膜,湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。,转膜方法,丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,转膜后检测,转膜后的封闭,脱脂奶粉 BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立
4、即加入一抗溶液与滤膜温育。,一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育1-2小时。,一抗、二抗孵育,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法 碱性磷酸酶法 化学发光显色法,AntiHis,应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体,Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离,Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭,Step3：加入待检病人血清，漂洗,Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗,Step5：加入显
5、色底物（或放射自显影），显色检测,Western Blot原理简介Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,内容概要,Western blot常见问题SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,Q,A,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶
6、板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,Western blot常见问题SDS-PAGE电泳,Q,A,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,Western blot常见问题转膜及抗体检测,Q,A,蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚,蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的
7、膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间,Western blot常见问题蛋白转膜效率低,A,R,Western blot常见问题显色背景高,一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合,制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合,A,R,Western blot常见问题显现非特异性条带,分子量Marker：确定蛋白条带的分子量已知量标准产物的正对照空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的内参：看家基因编码表达的蛋白,参照体系,TIANGEN产品结构底物显色液,HRP-DAB底物显色试剂盒Western blot中的应用,HRP-DAB底物显色试剂盒免疫组化中的应用,HRP-DAB底物显色试剂盒应用,Pro-light HRP 灵敏度检测试验,ProLight HRP 化学发光 试剂盒检测结果,
