1、-1-,药品无菌保证 基本原理,江苏 无锡 2006-09 邓海根 ,-2-,内 容,微生物基础知识简介 热力灭菌基本原理 药典对最终灭菌产品的无菌标准 注射剂常见灭菌方法 灭菌工艺的验证 常见灭菌设备介绍（示意） 容器密封可靠性验证,-3-,第一部分 微生物基础知识简介,-4-,一、微生物生存的环境,人类生活的环境充斥着大量微生物 海拔100英里（约160公里）以上 海平面以下600英尺（约182米）的地方都可以发现微生物的踪迹 1英里=5,280英尺或1.609公里,-5-,一、常见微生物,-6-,一、真菌和细菌,-7-,一、微生物分布特点,微生物无处不在 气源性微生物革兰氏阳性菌较多 它
2、们可形成芽孢，难以杀灭 因此，药品生产需要HVAC水源性则革兰氏阳性菌居多 不会生成孢子 但会形成细菌内毒素 耐热性差,G+,G-,-8-,一、生长态菌及孢子,将植物比喻微生物，不恰当而直观 如玉米，发芽 生长 种子，前二种相当于微生物的生长状态，到了种子，对环境的（水分、温度等）耐受性大大增强 然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体，植物没有这种相对应的东西 革兰氏阳性菌：气源性，身体上部，呼吸道 革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同 生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。,-9-,一、细菌芽胞（孢）的形成及其特性,摘自 http:/www.microbe.org/
3、microbes/spores.asp,内生孢子产生于 Gram+ 细菌:芽孢杆菌属Bacillus梭菌属Clostridium仅含核酸及少量萌发必需物皮层含DPA和Ca2+复合物能抵御各种恶劣环境可休眠上百万年真菌孢子因不具上述特性 而不耐热 DPA：吡啶二羧酸,-10-,一、生物指示剂（BI）的定义,对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28） 特点 用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性 相用于被验证产品、灭菌工艺、生产工艺 符合有关法规的要求,-11-,一、什么是芽孢？,当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为保护自身，在
4、细胞内形成一外壁厚而坚硬的体眠体，该体眠体即称芽孢（Spore）或孢子。 由于其对不良环境的耐受性远高于生长态细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被灭菌物品无菌的可靠性。,-12-,一、芽孢的特性,主要产生于Gram+ 细菌的两个属 芽孢杆菌属 Bacillus 梭菌属 Clostridium 能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它 有厚的皮层结构 仅含核酸及少量萌发必需物 含水量极低 休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性。,-13-,芽孢的特点,耐热 80 下长期存活 100 下有相当高的存活率 100 以上死亡过程符合一级动力学方程 影
5、响芽孢耐热性的因素 芽孢存在的介质 受热时的湿度,-14-,生物指示剂（BI）,对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28） 特点 芽孢 用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性,-15-,第二部分 热力灭菌基本原理,-16-,热对微生物的作用,当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白质、酶及核酸时，细胞死亡。 生命基本物质的破坏本质上是化学变化 实验证明微生物受热死亡速度符合一级动力学方程,-17-,一级动力学方程式,dN/dtK(N0Nt)N0为t0时，存活的微生物数；Nt为t时被杀灭的微生物数；N为t时存活的微生物数K为常数。
6、对数规则,-18-,微生物存活数与灭菌时间关系图,半对数座标,Y轴：微生物取对数 X轴：时间为10进制普通座标,-19-,芽孢的耐热参数：D值,指一定温度下将微生物杀灭90 或下降一个对数单位所需要的时间。,-20-,灭菌温度对D值的影响,灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长,-21-,F0值：达到同一灭菌效果的概念,F0值即标准灭菌时间 指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条件（121）相同灭菌效果的曝热时间,-22-,不同灭菌温度下的灭菌率,灭菌率：为达到与某一温度下灭菌1分钟相同的灭菌效果，在121下灭菌所需要的灭菌时间 100灭菌时1分钟，相当于121 灭菌0.008分钟，即Fo值为
7、0.008分钟。105灭菌40分钟时，Fo约为 1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位,-23-,第三部分 药典对最终灭菌产品的无菌标准,-24-,无菌检查的局限性,历史的教训： 1962年，美国FDA颁布第一部GMP 1970-1975年，美国输液污染至败血症400多起-有问题的产品全部通过了无菌检查 无菌检查的风险（另稿有示例说明）,-25-,药典对无菌保证的定量标准,1973年的英国药典和1980年USP增补版提到了无菌的量化标准 Fo不小于8分钟 经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百万分之一。 中国药典在2000版起，收载了此标准。 无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，
8、经灭菌后，产品的无菌保证值不小于6,SAL F0/D lgN0 假定D121为1,无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系,过度杀灭示意,生产中Fo=8示意,-27-,“无菌”的标准及概念,“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。 然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。 这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。 量化指标 + 计算 + 试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准,-28-,产品灭菌完全的必要措施,从公式SAL F0/D lgN0看灭菌完全的必要措施 足够的F0值
9、产品灭菌前污染菌检测 需氧菌总计数（微生物污染水平） 污染菌耐热性,-29-,产品灭菌完全的必要措施-2,通常采用的中间控制手段： 对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。 样品须作需氧菌总计数 将检品液置于100下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢存活 须对微生物学检测结果进行趋势分析。,-30-,产品灭菌完全的必要措施-3,FDA要求“ 对于在灭菌前产品污染菌检测中所发现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用生物指示剂的耐热性进行对比”,-31-,产品灭菌完全的必要措施-4,具体要求： 如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌
10、工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。 如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热性，则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工艺重新进行验证(可以使用生产中的分离菌)。 如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那么，这种情况发生的概率是非常小的。,-32-,无菌保证水平举例,假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（D）为1分钟，要达到药典规定的SAL不小于6的标准，灭菌F0值应达到多少？相当于121 和115 下灭菌多少分钟？ 答：F0=（SALlgN0）D =（6+ lg100）1= 8分钟，需在121下灭菌8分钟。 换算成115 下的灭菌时间是
11、：F0 /L115=8/0.25=32分钟。,-33-,某复方氨基酸注射液采用110，30分钟的灭菌程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，D值为0.5分钟，请计算无菌保证值和残存微生物污染的概率。 答：其SAL为：SAL= F0/D - lgN0 = L110t /D - lg100 = 0.0830/0.5-2 = 2.8 残存微生物的概率为10-2.80.158 通过无菌检查的概率为(1-0.158)20=96.9%。,无菌保证水平举例二,-34-,第四部分 注射剂常见灭菌方法,-35-,湿热灭菌-1,湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式） 实际上只要微
12、生物处于达到水水蒸气平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌 例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入1ml水并密封。 水分的存在有利于灭菌,-36-,湿热灭菌特点,蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞蒸汽热穿透性强灭菌效率高 温度相对较低 灭菌时间相对短 灭菌过程不产生任何化学物理污染 灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理,-37-,湿热灭菌工艺之一,美国FDA规定的残存概率法 灭菌过程8 F012分钟 适用于热稳定性不很好的产品 通过控制工艺过程的微生物污染和灭菌工艺参数使产品无菌 无菌保证值不小于6,-38-,湿热灭菌工艺之二,过度杀灭法 F0不低于12 热稳定性好的产品 以彻底杀灭
13、任何污染的微生物为实现无菌的手段 无菌保证值不小于6,-39-,其它湿热灭菌工艺？,F0值低于8的灭菌工艺 热稳定性很差的产品 以无菌生产工艺为基础，灭菌是提高无菌保证水平的辅助手段 不计算F0值，污染概率不大于0.1% 除血液制品外，发达国家这类大容量注射剂几乎没有 小容量注射剂也少见,-40-,无菌灌装与流通蒸汽灭菌,PDA参数放行-1999-10-21文件中指出： 如果产品在最终灭菌前采取无菌灌装，那么该产品的灭菌工艺可以采用较小的F0值（如F08min） 这当然是对热稳定差的产品采用的方法 此提法和欧盟GMP无菌药品附录一致 这一原则还没有被我国制药行业所认可，我国企业只认可流通蒸汽灭
14、菌，却忽视了无菌制造工艺的关键要求,-41-,不同工艺无菌保证比较表,-42-,干热灭菌机理,干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，符合“ 对数规则” ，但灭菌的机理却并不相同。 干热灭菌为何需较高的温度？ 水份的影响：湿度低 机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不是使蛋白质变性,-43-,干热灭菌要点,干热灭菌的介质通常是热空气 用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差 温度高，200 以上，有可能到320 用于玻璃容器、手术器械等 无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源,-44-,干热灭菌与去热原的关系,去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间FH 的数十倍。 如
15、果干热法去热原工艺能使细菌内毒素下降3个对数单位，就不必再进行微生物的生物指示剂挑战性试验。,-45-,第五部分 灭菌工艺的验证,-46-,灭菌工艺的验证,灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注册的必报材料 灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等） 灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同） 灭菌工艺验证资料包括 灭菌设备的安装确认 灭菌设备的运行确认 灭菌工艺的验证 先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准 空载热分布找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点 不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验产品获得的F0 生物指示剂验证-微生物挑战性试验,-47-,灭菌过程的Fo 示意,-48-,热力
16、灭菌常用生物指示剂,资料来源：参数放行专题材料,-49-,第六部分 常见灭菌设备介绍,-50-,灭菌设备,1、混合蒸汽灭菌柜 2、下排式蒸汽灭菌柜 3、脉动真空蒸汽灭菌柜 4、旋转喷淋灭菌柜 5、隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图,-51-,混合蒸汽灭菌柜,SAM= steam air mixture 蒸汽空气混合灭菌柜 混合汽体灭菌柜进蒸汽的管没画出顶上用一风扇，使灭菌均匀 无风扇时，灭菌容易不均匀热交换器控制冷却速度,-52-,下排式蒸汽灭菌柜,热蒸汽在上 冷空气在下 蒸汽挤空气,-53-,脉动真空蒸汽灭菌柜,有高真空及 脉动真空二种形式 第二种比较常见 抽99%，剩1% 3次真空，残存的空气为0
17、.1%,密封圈,-54-,旋转喷淋灭菌柜,纯化水或注射用水 作传热介质-过热水 灭菌加热时开工业蒸汽 冷却时，可用冷冻 水或自来水冷却产品转动，受热均匀软袋灭菌时，用过热水 较多，但需加压缩空气,-55-,干热灭菌柜,常见程序：1802小时，细菌内毒素下降3对数单位,-56-,隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图,瓶清洁,排水汽,预热,去热原,冷却,干热灭菌,层流 保护,洗瓶及灭菌、去热原为联动线,B区,-57-,冰浴 0.01,油浴 121,数据采集器,参照仪,验证仪校准,灭菌柜热分布验证试验图示,-58-,第七部分 容器密封可靠性验证,-59-,密封系统完好性-物理法,待确认的密封口,WFI,支架,
18、氯化钠溶液,容器,经灭菌后，氯化钠有否进入瓶内？,-60-,密封系统完好性-挑战试验,待确认的密封口,培养基,支架,菌液 如108个菌/ml,容器,大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌,-61-,产品存放期密封可靠性检查-1,微生物侵入试验 往产品容器内灌入培养基并按常规方式压塞轧盖，灭菌后冷却备用。 将冷却后的容器倒置，并将瓶口完全浸没于高浓度的运动性细菌溶液(如108个菌/ml)内，如有大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌。 将容器外表面消毒并培养，看容器内是否有挑战性细菌生长。,-62-,产品存放期密封可靠性检查-2,此试验条件比实际储存和运输时产品遭微生物污染的条件要苛刻得多。
19、 另应多留一些装有培养基产品的容器，并置于与稳定性样品相同的贮存条件下存放。 每隔一定的时间间隔（如12，24，36和48个月等），取出部分容器，按上述方法进行检测，以确定密封系统的稳定性。,-63-,产品存放期密封可靠性检查-3,应证明产品经最长灭菌时间后，容器/胶塞系统依然保持良好的密封性。 如果某产品在生产过程中不止灭菌一次，那么在密封完好性验证方案中，应取灭菌程序最长时间的样品作验证试验。,-64-,小 结,细菌芽孢死亡规律符合一级动力学方程 无菌检查有明显的局限性 药典规定最终灭菌产品的污染概率不超过百万分之一，即无菌保证值SAL不小于6 SAL F0/D lgN0 F0值标准灭菌时
20、间 D值微生物耐热参数 N0灭菌开始前微生物污染数,-65-,小 结-续,FDA将湿热灭菌工艺分为二类： 过度杀灭法 Fo不小于12 残存概率法Fo不小于 8 Fo值低于8时，应采用无菌制造工艺，并用加热方法提高无菌保证水平 这是一种补充手段，可看作消毒 非最终灭菌产品的无菌保证水平为0.1%,-66-,思考题,请解释药典的无菌标准 除菌过滤的LRV指什么，生产中实际能达到何种无菌保证水平？无菌制造工艺的污染风险主要来自过滤，此理解对否？LVP产品药液是均一的，因此污染也是均一的，对否？说明再由 100 30分钟灭菌后，产品无菌检查合格，该批是否符合无菌要求？ 热力灭菌工艺最终灭菌产品的无菌取决于什么？,灭菌程序验证中，应将耐热性最强的芽孢，以106浓度接入产品中，并在灭菌后下降6D或12D，此理解对否？ 简述湿热灭菌工艺的生物指示剂验证，BI的装载要求 使用残存曲线法测定D值时，如何确定试验参数？ 灭菌时发生停电，第一次灭菌Fo为2，再次灭菌为6，问灭菌是否完全？,
