1、非程控降温80冷冻保存外周血干细胞及应用研究世界肿瘤杂志 2003 年第 2 卷第 1 期TumourJournaloftheWorldVolume2,Number1,Mar2003?29?非程控降温一 8O冷冻保存外周血干细胞及应用研究黄一虹鹿群先李德鹏李宝林陈令松李振宇主鸿鹄潘秀英摘要:目的为外周血造血干细胞(PBSC)的冷冻保存建立简便,经济且有效的方法并应用于临床.方法采用 6.25%-甲基亚砜(DMSO)加 7.5o/0旋糖酐(DI 三)() 为冷冻保护剂,将 21例恶性血液病患者行千细胞动员,采集获取的 PBSC 浓集液与细胞冻存液混合 ,不用程控降温而直接将分装后的混悬液和小样本
2、保存于.80“(2 冰箱中.于冻存前和冻存后 1 周,1 个,3 个月和 6 个月时分别取样分析,检测细胞回收率和台盼蓝拒染率.结果冻存 1 周和 1 个月其细胞回收率和存活率无明显差别(.05),冻存至 3 个月时细胞活性及 CD 细胞回收率明显降低 (尸_0.01),但不随贮存期延长而进行性下降.19 例移植患者输注经保存后的 PBSC 均获得造血重建 .结论非程控.80“(2 冷冻技术是一种简便,经济和有效的造血干细胞冻存方法,且能很好地保存 PBSC 的造血潜能.关键词:外周血造血干细胞;非程控降温;冷冻保存:二甲基亚砜:右旋糖酐Theeffectsofsimplifiedmethod
3、foreryopreservationofperipheralbloodhematopoieticstemc,dlsat 一 80“Cwithoutrate-controlledfreezing.HUANGYi-hong,LUQlln-xt 口 n1.L1De-Peng1.L1Bao.1ing2.CHENLing-song3,LIZheng-yu1.ZHUHong-gu,PANXiu-ying(DepartraentofHematology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege.Xuzhou221002,China)Abstract:Objec
4、tiveToestablishsimple,inexpensiveandeffectivemeodsforthecryopreservatonofperipheralbloodhematopoieticstemcells(PBSC),andtoevaluatetheeffectsofthenewmethodofcryopreservation.MethodsTwenty-onePBSCsampleswhichgotfromthepatientswhowoll1dreceivetheautologousperipheralbloodstemcellIransplantation(APBSCT)a
5、ndmeirsmallvolumesamplesweremixedm6.25%dimethysulfoxide(DMSO,and7.5%dextran(DEX)at4“Candstoredat 一80Cdirectlywithoutrote-controlledfreezingfor1weekand1-6months.Theyweredtedthecellrecoveryandtrypan-blueviabilitystoredafter1week.1month,3monthsand6months.Resultsncellrecoveryandtrypan-blueviabilityforcr
6、yopreservationofPBSCat 一80“(2for1weekand1monthhadnothe0bvi0uSdifferences(尸).05).For3monthscryopreservafionofperipheralbloodmononuclearcells(MNC),themeanrecoveries0fandgranuloeytemaerophagecolonyformingunits(CFU-GM)andCD34+cellsandthemeantrypan-blueexclusionratewere,respectively,(88.94.6)%,(85.716.9)
7、,(84.25.5)/o,(82.14.9,%.Thecellrecoveryandtrypan-blueviabilitystoredfor3monthsand6monthshadnosignificancetoo(.05).AlltherecipientsonAPBSCTgothematopoieticreconstitutionsuccessfullyinashortperiod.Conclusion111enewmethodinvitroisprovedreallyimpleandsafe.Furthermore,thesesimpleand收稿日期:2003-01-12作者单位:l
8、江苏省徐州医学院附属医院血液科徐州 2210022 徐州市中心血站2210023 徐州医学院第二附属医院221004作者简介:黄一虹(1964-).男 (汉).江苏泰兴市人.硕士学位,副教授,副主任医师,科副主任.主要研究方向:造血干细胞移植.木研究原着木?3O?世界肿瘤杂志 2003 年第 2 卷第 1 期TttmourJournaloftheWorldVohtme2,Number1,Mar2003inexpensivemethodscanexcellentlymaintainproliferativecapacityofPBSC.Keywords:peripheralbloodhemato
9、poieticsteincells;cryopreservation;withoutrate-controlledfreezing;dimethysulfoxide;dextran.外周血造血干细胞(PBSC) 的冷冻保存是自体外周血干细胞移植(APBSCT)工程中的重要环节之一.使用 10%二甲基亚砜(DMSO)为 PBSC 低温保护剂,程控降温一液氮保存是采用多年行之有效的冷冻保存技术,但其成本昂贵,操作复杂,难以普及.我们尝试了一种新的低温保存方法,采用 80“C 冰箱中直接冻存 PBSC,取得了满意的效果 ,报道如下.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 样本来源恶性血液病和实体瘤患者
10、 21 例,男 12 例,女 9 例,中位年龄 32.5(7-54)岁.其中急性髓系白血病 7 例,急性淋巴细胞白血病 3 例,慢性粒细胞白血病 1 例,非霍奇金淋巴瘤 7 例,霍奇金淋巴瘤 2 例,晚期乳癌 1 例.除 1 例乳癌处于进展期外,其余均处于完全缓解期,经 HAM(大剂量阿糖胞苷,米托葸醌)或 MOED(米托蒽醌,长春地辛,足叶乙甙,地塞米松)+造血生长因子(G.GSF 和/或 GM-CSF)动员后,由 Baxter 公司的 CS3000plus 血细胞分离机连续 2d 采集获得PBSC 浓集液 J.1.1.2 主要试剂及仪器冷冻保护剂 CP.80 溶液(上海市血液中心提供),1
11、0%人 AB 型血清,淋巴细胞分离液,RPMI1640 培养基,低温冷冻管,含ACB 的采血袋 :冷冻贮存器为.85冷柜(SAIkIYO,MDF.192).80恒温.1.2 方法1.2.1PBSC 的冷冻保存及融冻冷冻保护液的制备 CP.80 溶液(成品每瓶 68mL),其中含 6.25%DMSO,7.5%DEX,6.25o/0 虬 B,0.25%L.谷氨酰胺,80%TCE 骨髓保存液,置 4“C 冰箱内贮存备用.冻存将 PBSC 浓集液(MNC 悬液)经 4“C 预温并行细胞计数.经适量稀释后与 4 体积的冷冻保护剂充分混匀(边加边混,此步骤在冰水上操作),使有核细胞浓度在(l0) 10m?
12、L 内,冷冻保护剂 DMSO 的终浓度为 5%,同时用 0.5%台盼蓝检测细胞拒染率.细胞浓集液分装成两类:100mL/袋用于临床,2mL/管用于实验.随即将两类混悬液直接放入.80“C 非程控冰箱冻存 .于 1 周,1 个月,3个月和 6 个月后冰箱中取出融冻.融冻将上述冻存的样本小管从.80“C 冰箱中取出 ,迅速置 40“C 水溶中复温至全部融化(约 lmin)后,将此冻存液用含 10%人 AB 型血清的 RPMI1640 培养液缓慢稀释5 倍后,留取部分冻存液作 MNC 和 CDJ 细胞计数及台盼蓝染色,其余部分冻存液以 1500r?min离心 10min,弃上清液,用 RPMI164
13、0 培养液洗涤 2次,加入含 10%AB 型血清的 RPMI1640 培养液,制成所需浓度的 MNC 悬液,供粒.单系造血祖细胞(CGM)测定.1.2.2 质量观察指标MNC 回收率:3%醋酸作细胞稀释液,在低倍镜下计数 MNC,计算 MNC 的回收率.每管冻存后 MNC 总数MNC 回收率(%): 100%每管冻存前 MCN 总数台盼蓝拒染试验计数 0.2%台盼蓝生理盐水于细胞悬液等量混合,2min 后在高倍镜下计数每100 个 MNC 排斥台盼蓝的存活细胞数.CFU.GM 回收率用甲基纤维素法测定CFU.GM.冻存前后接种 MNC 悬液浓度为 210.?mL,将 210 个 MNC 接种于
14、直径为 35ram的塑料培养皿中,每 mL 培养体系中含有 0.9%甲基纤维素,30% 胎牛血清,1% 牛血清,50rig 粒.巨噬细胞刺激因子(GM-CSF),10M2. 巯基丙醇,于37,1.14retool?LCO2,2.28mmol?LO2,饱和温度培养箱中培养 14d,在倒置显微镜下计数CGM 的生长集落(40 个粒单系细胞的细胞团为 1 个集落)数,每份取其 3 个培养皿集落的均数,根据 NMC 总数,计算出 CFU.GM 总数和 CFU-GM的回收率.冻后 CFU-GM 总数CFU-GM 的回收率 (%)=冻前 CFU-GM 总数CD34+细胞计数采用间接免疫荧光流式细胞仪检测
15、CD34+细胞,分析 510 个细胞,得出CD34+细胞含量,计算 CD34+细胞回收率.冻后 cD 细胞数cD 细胞回收率 (%):冻前 cD 细胞数世界肿瘤杂志 2003 年第 2 卷第 1 期TumourJournaloftheWorldVolume2,Number1,Mar2003:!:1.2-3 统计学处理配伍组试验采用 t 检验和方差分析.2 结果2.1 经.80“C 直接冷冻保存不同时间后的 MNC 回收率,台盼蓝拒染率,CFU.GM 回收率和 CD3 细胞回收率结果见表 l.2.2l9 例 APBSCT 患者造血重建情况2.2.1APBSC 回输量回输的 MNC(4.671.9
16、8)10?kg,CD3 细胞(6.432.36)10.?kg ,CFU.GM(2.381.77)l0?kg-.2.2.2 造血功能恢复情况白细胞(WBC)在+6(3-9)d 降至 0,血小板(BPC)在+l0(12)d降至(1020)10?L;WBC1.010L,中性粒细胞绝对值(ANC)0.5l0L,BPC2010?,BPC5010?L 的时间分别为+12(8-17)d,+13(9-17)d,+15(11-20)d,+16(13-23)d.移植后 23 周骨髓穿刺检查造血功能均获满意重建,至随访结束时无造血功能障碍.表 lPBSC 在.80X2 冰箱中冻存不同时间的结果 (x.n=21)Ta
17、blc1TheresultsofPBSCinthedifferentcoldtimeat 一 80注:Pl 为 1 周与 1 个月比较 ;P2 为 1 个月与 3 个月比较; 为 3 个月与 6 个月比较;P4为 1 个月与 6 个月比较3 讨论APBSCT 具有造血重建快,重建免疫功能强,肿瘤细胞污染少,感染和出血少等优点,已成为治疗恶性血液病的主要方法之一,与此同时,PBSC的长期体外保存作为移植成功的关键环节之一已成为亟待解决的问题.近年来,PBSC 的冻存出现了简易化的趋势,国外自 90 年代以来有这方面的报道J.即使用 DMSO 联合羟乙基淀粉(HES)作为造血干细胞的保护剂,低温冰
18、箱直接冻存,并取得了与标准方法类似的结果,MakinoL6J 认为 5%DMSO+6%玎巳 S 是保持复温后细胞不发生膨胀的最佳组合,有较高的的细胞回收率而没有细胞凝集现象.国内关于非程控.80直接冻存 PBSC 的应用研究报道较少【7】.我们借鉴国内外经验对冷冻保护剂配方进行改进,用右旋糖酐代替难以溶解的羟乙基淀粉,以 DMSO/DEX 混合物为冷冻保护剂,于.80冰箱非程控降温直接冻存 PBSC,与标准的方法比较具有以下优点:2 种冷冻保护剂联合使用,能发挥协同作用,减少 DMSO 用量,因而可减少DMSO 对人体及造血干细胞的毒性作用【8】.DMSO作为一种渗透性保护剂,能快速穿透细胞膜
19、进入细胞内,降低冰点及延缓冷冻过程,使细胞有充足的时间适应降温变化,以减少低温下损伤,同时提高胞内离子浓度,减少胞内冰晶的形成【6J.DEX 与HES 均为非渗透性保护剂,不易进入细胞内,但能使细胞脱水,从而减少胞内冰晶的形成,对细胞膜有保护作用.两种不同性质的冷冻保护剂联合应用,发挥协同作用.冷冻保存的效果确切.非程控降温直接将造血干细胞放入.80“C 冰箱冻存方法的理论依据是这种降温方式的降温速率近似理想降温条件.Clark 等【9】研究表明能通过调整冻存体积及装冷冻袋的贮存盒的空间结构,获得.70“C 冰箱直接降温理想的曲线.操作简便,并可节省购买程控降温设备及液氮保存的昂贵费用,有利于
20、普及应用.本试验于.80“C 冰箱非程控降温直接冻存 PBSCl 周6 个月,1 个月内融冻复苏细胞回收率和存活率无明显降低,获得了良好的保存效果.3 个月后MNC,CFU.GM 和 CD34+细胞回收率及台盼蓝拒染率虽有所下降,结果分别为(88.94.6)%,(85.7l6.9)%,(84.25.5)%,(82.14.9)%,且不随贮存期延长而进行性下降,与用 l0%DMSO 程控降温一液氮贮存效果一致 0】,说明该方法不仅适用于中短期保存,还可适用于长期保存.传统的低温保护剂中 DMSO 终浓度为 l0%,本研究使 DMSO的用量减少 l/2,从而减轻了 DMSO 对 PBSC 的毒性作用
21、和临床上输入患者体内过多的 DMSO 所带?32?世界肿瘤杂志 2003 年第 2 卷第 l 期TurnoutJournaloftheWorldVolume2,Numberl,Mar2003【3】【4】【5】(上接第 25 页)preoperative=l 啪 CA125levelsinclinicallylocalizedandadv 丑 IIcedendomiale.arcinoma.AmJObstctGyneo1.1988Feb.158(2):399-402.SoodABullcrRE,BurgerRDawsonJD,soroskyJI,BcrrnanMValueofpreopcrati
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