1、（每年约 200X109 吨的产量），中国每年约产生 10 亿吨农业和森林废弃物 , ，但是其中只有 3%在非食品领域比如造纸和纸浆得到使用 。通过木糖异构酶路径发酵木糖的耐热工程酵母的构建#510摘要：为了提高耐热酵母 Kluyveromyces marxianus 利用木糖发酵的能力，在此酵母中重建了通过木糖异构酶的代谢路径。其中内源木糖还原酶及木糖醇脱氢酶的基因被敲除，而来自Orpinomyces 的木糖异构酶在密码子优化以后在这个双重敲除株中进行表达。获得的菌株进一步通过 32 轮转接驯化后得到了一个能够快速利用木糖的菌株 YRL005。在 42C 此菌株利用木糖的生长率为 0.154
2、/h； 可以利用 30.15 g/l 木糖产生 11.52 g/l 乙醇，得率为 0.38g/g, 生产率为 0.069g/l/h；并且没有木糖醇及甘油的积累，是目前已知在 42C 以上利用木糖发酵的最好菌株。关键词：木糖；木糖异构酶；耐热酵母；乙醇；发酵中图分类号：Q-3115Improving the xylose fermentation at elevated temperatureWANG Rongliang, WANG Dongmei, HONG Jiong(School of Life Sciences, University of Science and Technology
3、of China, HeFei )Abstract: ITo improve the xylose fermentation ability of a thermotolerant yeast, a xylose2025303540assimilation pathway through xylose isomerase was constructed. The genes encoding xylosereductase (KmXyl1) and xylitol dehydrogenase (KmXyl2) were disrupted in K. marxianusYHJ010 and t
4、he resultant strain was named YRL002. A codon-optimized xylose isomerase genefrom Orpinomyces was transformed into K. marxianus YRL002 and expressed under GAPDHpromoter. The transformant was adapted in the SD medium containing 1% casamino acid with 2%xylose as sole carbon source. After 32 times tran
5、s-inoculation, a strain named YRL005 which cangrow at a specific growth rate of 0.154/ h with xylose as carbon source was obtained. K.marxianus YRL005 could ferment 30.15 g/l of xylose and produce of 11.52 g/l ethanol with ayield of 0.38 g /g, production rate of 0.069 g/ l h at 42C. It is a good pla
6、tform to constructthermo-tolerant xylose fermentation yeast.Keywords: xylose; xylose isomerase; thermo-tolerant yeast; ethanol; fermenatation0 引言温室气体排放的增加和全球的温暖化、石油资源的枯竭和日益上涨的能源需求，以及国家能源安全问题使得可再生能源的利用和开发是成为 21 世纪最重要的课题之一。其中从生物质生产燃料乙醇是其中重要的一个方向。木质纤维素类是地球上最丰富的可再生生物资源1 23天然的木质纤维素类主要是植物纤维原料，主要成分含有 40-50
7、%的纤维素、20-30%的半纤维素，另外还有木素等组分。其中半纤维素主要成分是木聚糖，木聚糖的水解主要产物是木糖。迄今为止发现很多种微生物能够代谢木糖产乙醇，包括细菌、真菌和酵母菌。酵母木糖代谢和发酵代谢途径比葡萄糖代谢途径复杂得多,首先是在依赖 NADPH 的木糖还原酶（XR）的作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖 NAD+ 的木糖醇脱氢酶（ XDH）作用下氧-1-化形成木酮糖,再经木酮糖激酶（XK）磷酸化形成 5-磷酸木酮糖,由此进入磷酸戊糖途径（PPP）。 PPP 途径的中间产物 6-磷酸葡萄糖及 3-磷酸甘油醛最终形成丙酮酸。丙酮酸或是45505560657075经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢
8、酶产乙醇，或是在好氧条件下,最终通过三羧酸循环（TCA）及4入的只有三种酵母，即休合塔假丝酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母。但这些酵母的乙醇耐受性比较低，或者乙醇发酵能力还不够高，使它们的应用受到限制。与之相对应，细菌和一些真菌通过木糖异构酶（XI）体系进行木糖代谢和发酵。与木糖的还原氧化体系不同，木糖异构酶体系通过异构酶将木糖直接变成木酮糖。在这个过程中无56污染能力等问题，而在应用上受到限制。7-10偏好 NADPH，而木糖醇脱氢酶的辅酶为偏好 NAD+，这就导致采用这个体系在厌氧条件下11木糖转化成乙醇的效率降低，而且会有大量副产物木糖醇的积累。而木糖异构酶体系理论上可以解决这个问题。最
9、近，木糖异构酶体系也取得了一些突破。研究人员通过转入来源于厌氧真菌 Piromyces sp. E2 的木糖异构酶得到了一株 TMB202 的酿酒酵母，有较好的乙醇得率（0.42g/g D-木糖），但是有木糖醇（2.8mM）副产品；最近，日本的一个研究组将来自瘤胃真菌 Orpinomyces 的木糖异构酶在酿酒酵母中表达成功，取得了类似的结果（0.48g/g D-12异构酶体系导入酿酒酵母中，乙醇得率为理论值的 61.9%，如同时敲除了宿主自身的一个编码非特异性醛糖还原酶基因（GRE3 基因），木糖消耗量和乙醇产量比敲除前提高了一倍以13具有在较高温度（42oC)下进行发酵的能力， 而且仍然都
10、有较多的副产物例如木糖醇、甘油等产生，这些都是需要解决的问题。在高温下发酵将带来以下优势：1. 降低发酵中的冷却费用；2.提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵（SSF）温度，促进糖化，减少花费在酶上的费用；3. 降低污染。发酵的温度的提高可以抑制许多杂菌的污染。据 Akada 统计，采用淀粉为材料的 3 万吨规模的乙醇企业，如果发酵温度上升 5，可以节约 3 万美元/年的降温费用。同步糖化过程中，14染带来的乙醇发酵得率急剧下降的损失不好估算，一个 260 吨的发酵罐中因污染被迫重新发酵的代价是 5 万美元。除此之外，高温发酵可以促进发酵后的处理如提高蒸馏效率，降低蒸馏费用。所以采用
11、耐热酵母发酵受到越来越多的关注。本研究采用 K. marxianus 也是一种 GRAS (general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。K. marxianus 有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵 151680 酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于 K. marxianus 有很多比酿酒酵母优秀的品质，K. marxianus 被越来越多的用于生物能源的生产。在木质纤维素的同步糖化和发酵过程（SSF ）中，大多数发酵是采用酿酒酵母在中温进行(25 37),而商业化纤维素酶半纤维
12、素酶的最适温度多为 48-50左右，采用耐热酵母在较高温度 (4250)下发酵更有利于呼吸链彻底氧化成 CO2 。目前已知至少 22 种酵母能转化 D-木糖成乙醇，其中研究较为深需辅酶来氧化还原，在厌氧条件下利用木糖不会产生还原力的不平衡 。这个体系主要存在细菌中，在少数低等真菌中也存在 。但这些细菌由于乙醇产率、乙醇耐受性、副产物及抗工程酵母中多采用氧化还原体系。其中以酿酒酵母为多 。由于木糖还原酶的辅酶为酵母细胞内的还原力不平衡，使大量的木糖醇不能被氧化而累积，影响木糖的发酵 ，导致木糖） ，但是木糖醇积累达 2.83 g/L, 甘油积累达最高达 2.05 g/L。Kondo 研究组把木糖
13、上 , 不过仍然有 0.51g/l 木糖醇和 2.20g/l 甘油产生。目前这些通过异构酶路径的酵母都不如果在 40糖化可以比在 32糖化节省 50%在酶上的花费（ 25 万美元/年） ，另外由于污。K. marxianus 能够利用木糖在较高的温度下生长 ；能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒-2-纤维素酶半纤维素酶发挥水解能力，促进对木质纤维素的利用，提高糖化与发酵同步反应的85 17耐热酵母 K.marxianus，利用葡萄糖在 30可以达到与酿酒酵母同等的发酵能力，在高温条件下(45), K.marxianus 在发酵乙醇上有绝对的优势 15, 18株能直接发
14、酵木糖产乙醇 16, 19-21当的利用葡萄糖发酵能力，又有酿酒酵母不具有的木糖利用及发酵能力，从理论上分析，在9095100105110115120葡萄糖、纤维二糖及木糖的共发酵工程菌的改造方面 K.marxianus 比对酿酒酵母更有潜力。在此基础上，本研究通过敲除 K.marxianus 效率低下的木糖氧化还原体系，引入木糖异构酶体系，成功构建了在高温下利用和发酵木糖的工程菌 K.marxianus YRL005。该工程菌解决了之前耐热酵母在高温下木糖发酵能力低的问题，乙醇产量大幅度提高，而且与之前的酿酒酵母体系相比没有木糖醇、甘油等副产物积累。1 材料与方法1.1 试剂和菌株本研究中的
15、所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂，其中 YNB（酵母氮源基础）、木糖、葡萄糖、酪氨酸、亮氨酸、尿嘧啶以及胶回收试剂盒均来源于上海生工生物工程公司；所有的限制性内切酶购自 Fermentas Life Sciences (Fermentas China, Shenzhen, China)；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，Solution I 连接酶以及 pMD18-T 载体购自于大连宝生物公司。PfuDNA 聚合酶试剂盒由上海申能博彩提供。大肠杆菌 Escherichia coli XL10 gold 菌株作为DNA 操作时使用的宿主菌。包含 100 g/ml 氨苄青霉素的 Lur
16、ia-Bertani (LB) 培养基用于培养E. coli；包含合适氨基酸的合成培养基（SD）用于转化子的筛选；含有 2%木糖和 1% Casaminoacid 的木糖合成培养基用于驯化。质粒 yEGAP，yEUGAP，pKmURA3 由本实验室保存。K. marxianus YHJ010，YZB001 为本室保存菌株。 YPD 培养基 (酵母提取物 10g/l ,蛋白胨20g/l,葡萄糖 20 g/l )用于酵母的前培养；YPX（酵母提取物 10g/l，蛋白胨 20g/l ，木糖 20g/l(或50g/l) ）用于发酵培养基。1.2 K. marxianus 木糖代谢路径中木糖还原酶及木糖
17、脱氢酶基因双基因敲除菌株的构建为了构建双重敲除菌株，在木糖还原酶基因 KmXyl1 已被敲除的 K. marxianus YZB001中将木糖醇脱氢酶基因 KmXyl2 进行进一步敲除。采用引物 URA3-Mfe-F 和 URA3-KpnI-R(表 1) 通过 PCR 将 KmUra3 基因从质粒 pKmURA3 22中扩增出来并插入到 KmXyl2 的 KpnI 和 EcoR I 位点之间。 然后，采用引物 XDH-F 和 XDH-R (表 1)将有功能的 KmUra3 和被破坏的 KmXyl2DNA 片段通过 PCR 扩增出来作为基因敲除框 。按照以前报道的方法进行转化和敲除22 。通过只
18、含有亮氨酸的合成培养基筛选双敲除菌株。为了重新获得 URA3 营养缺陷型选择标记，转入的 KmUra3 再次被敲除。通过 Bst1107I将 KmUra3 ORF 中间 594bp 的片段除去，获得破坏的 KmUra3 基因。然后将这段破坏了的KmUra3 基因 DNA 片段作为敲除框转化到 KmXyl1 和 KmXyl2 的双敲除菌株中，敲除KmUra3。通过在含有 0.1% 5-fluoro-orotic acid (5-FOA)的 SD 培养基上筛选获得敲除株。1.3 在双敲除株中表达木糖异构酶对 Orpinomyces.sp （瘤胃真菌）来源的 XI 基因 XylA，按照 K. mar
19、xianus 酵母中密码子效率 。所以利用 K.marxianus 发展成乙醇生产菌株非常有意义。虽然有一些 K. marxianus 菌，但其乙醇的产率较低。K.marxianus 有可以和酿酒酵母的相-3-进行优化，并通过基因合成获得 1334bp 密码子优化后的木糖异构酶基因。然后将 XI 基因DNA 通过 EcoR I 和 Not I 位点插入到质粒 yEUGAP 中。通过引物 GAP-StuI-F 和GAP-StuI-R (表 1)，以 yEUGAp-XI 为模板，扩增获得包括 GAPDH 启动子、XylA 和 GAPDH125 终止子的片段，并通过 Stu I 位点插入质粒 pKm
20、URA3 中。采用 Spe I 酶切线性化获得质粒后，按文献中所述方法转化 KmXy1 和 KmXy2 的双重基因敲除菌株，在含有亮氨酸的 SD 培养基上进行筛选。表 1 本研究中使用的引物130PrimerXI-EcoRI-FXI-NotI-RXDH-FXDH-RURA3-MfeI-FURA3-KpnI-RGAP-StuI-FGAP-StuI-RTable 1 Primers used in this studySequence (5 3)*ACGTGAATTCGAAACGATGACCAAGGAATAC TTCCCAACCATCGGATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGT
21、GGTGGTGTTGGTACATAGCAACGATAGCACCAACACTCAAAAAGCCGTGGACCATCAATGATAGTCTAAACCGTTCAATTGGAATTCTGATTGGAAAGACCAGGGGTACCTCGGTGCAAAAAACAGCTTCGAACCGGTACCAGTTCTCACACGGAACGAAGGCCTTCAATCAATGAATCGAAAATGTCAT*Restriction enzyme sites are underlined.*限制性酶切位点以下划线标出1.4 提高对木糖的利用能力的驯化135140145150在获得表达木糖异构酶基因的转化株之后，将其转接至包含
22、 1% casamino acid 和 2% 木糖的 SD 培养基中，在 37oC 培养 48 h 以测定其对木糖利用并进行生长的能力。然后这个菌株被转接到新鲜的上述培养基中， 起始 OD600 为 0.2， 每 72h 转接一次， 直到获得能够利用木糖快速增长的菌株。1.5 木糖发酵利用木糖发酵的实验分别在 42oC 和 45oC 进行。K. marxianus YRL005, YRL003,YRL002 或 YHJ010 (表 2) 分别在 50 ml YPD 中 42oC 下培养 24 h, 然后将细胞通过离心回收。在用无菌水洗后，接入装在厌氧瓶中的 40 ml YPX 培养基中，OD6
23、00 为 10。在 42oC 或45oC，以 250rpm 速度进行厌氧培养，每隔 24h 取样一次。1.6 玉米芯酸水解液的制备取 100g 玉米芯（产自河北唐山,半纤维素含量约为 36%）粉碎至粒径 30 目左右，按固液比 1:10（质量:体积）加入 1000 ml 1.0%的 H2SO4，在 110下水解 3 h。水解液在 70下用石灰乳（购自上海生工生物工程公司）中和至 pH10.0，立即趁热抽滤除去 CaSO4 沉淀后，用浓 H3PO4 回调 pH 至 6.0， 4静置过夜，抽滤去 Ca3(PO4)2 沉淀，所得水解液进一步进行脱色。用 0.4 mol/L 的盐酸浸泡活性炭（上海生工
24、生物工程公司）24 h，清水洗至中性，30晾干备用。取半纤维素水解液，将活性炭以 2.4%（W/V）的固液比与水解液混合，震荡脱色，脱色条件为：42下、250rpm、脱色 1h。真空抽滤后，上清液以 6000 rpm 离心 15 min。经HPLC 测定，玉米芯半纤维素水解液中木糖浓度为 29.61g/l，葡萄糖浓度为 1.62g/l。灭菌备用。-4-1551601.7 玉米芯酸水解液的发酵与 1.5 中描述的同样操作, K. marxianus YRL005 (Table 2)细胞从前培养中回收后接入装在厌氧瓶中的 40 ml YPX 培养基中，起始 OD600 为 10。在 42oC 或
25、45oC， 以 250rpm 速度进行培养。每隔 24h 取样一次。表 2 本研究中使用的酵母菌株Table 2 Yeast strain used in this studyStrainsK. marxianusYHJ010YZB001YLUA006YRL002YRL003YHJ005Relevant genotypeKmura3:KanrKmleu2:hisGKmtrp1:hisGKmura3:Kanr Kmleu2:hisG, Kmtrp1:hisGxyl1:trp1Kmura3:Kanr Kmleu2:hisG, Kmtrp1:hisGxyl1:trp1xyl2:Kmura3Kmura
26、3:Kanr Kmleu2:hisG, Kmtrp1:hisGxyl1:trp1xyl2: Kmura3Kmura3:Kanr Kmleu2:hisG, Kmtrp1:hisGxyl1:trp1 xyl2: Kmura3 KmUra3:xylAKmura3:Kanr Kmleu2:hisG, Kmtrp1:hisGReference2223This studyThis studyThis studyThis studyxyl1:trp1xyl2: Kmura3 KmUra3:xylA1.8 木糖、木糖醇、木酮糖、葡萄糖、甘油、乙酸及乙醇的分析发酵的样品通过离心去除酵母细胞后，上清采用 HPLC
27、（高效液相色谱）进行分析，色165170谱柱采用 Rezex ROA-Organic Acid H+(8%) (Phenomenex, Torrence, USA)，检测器为 Agilent1200，示差检测器(Agilent Technologies, Inc CA, USA)，流动相为 2.5 mM H2SO4，在 755 以0.3ml/min 的速度进行样品色谱分析。1.9 木糖异构酶的活性测定及蛋白质的定量分析将 5ml 的培养在 4oC，15000 g,离心 10 min 回收酵母细胞后，用无菌水洗两次并重悬于 1 ml buffer A (50 mM Tris-HCl, 25 mM
28、 NaCl, pH 8.0)中。细胞通过超声裂解后在 4 oC，15000 g,离心 20 min，上清用于木糖异构酶活性测定。测定方法依据 Madhavan 等报道的方法 12行。反应通过添加 20 mM 的木糖起始，在 37 oC 保温 15min 后，通过添加 25l 50% (m/v) 三氯乙酸 (TCA)终止反应，产生的木酮糖按照报道的酮糖测定方法进行测定24 。一个木糖异175180构酶活力单位定义为每分钟产生 1 mol 木酮糖所需的酶量。蛋白质的定量方法采用Bradford 法25 。2 结果与讨论尽管许多 K. marxianus 菌株能够利用木糖生长，但是利用木糖发酵的能力
29、很弱(Table 3) 。而 K. marxianus 的遗传改造又由于缺乏便利的基因工程工具而受到限制。这可能是 K.marxianus 能在 45oC 发酵葡萄糖，但对其木糖发酵研究并不是很多的原因。三重营养缺陷型的成功构建以及木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的克隆22,marxianus 木糖发酵的能力成为可能。 -5-，即在包含 50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 8.0），40 mM MgCl2 的 275l 反应液中进，使得通过基因工程手段提高 K.23, 262.1 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的双基因敲除大多数 K. marxianus 菌株具有能够利用木糖在好氧条件下生长的天然木糖代谢路径，
30、185190195200205210所以提高它的木糖发酵有一定的便利性。在本研究中分别编码木糖还原酶和木酮糖脱氢酶的KmXyl1 and KmXyl2 被敲除了，它们在厌氧条件下由于辅酶偏好不同会导致还原力不平衡。在 Kmxyl2 的敲除框转化 K. marxianus YZB001 后，通过筛选获得一个双敲除菌株。基因的敲除通过以基因组为模板的 PCR 进行确认。得到的菌株命名为 YLUA006。YLUA006 中的KmUra3 被进一步敲除，通过含有 5-FOA 的平板培养基筛选，获得一个敲除了 KmUra3 的KmXyl1 和 KmXyl2 双敲除菌株。这个菌株中 KmXyl1, KmX
31、yl2, KmUra3 和 KmLeu2 都被敲除了(表 2)。2.2 木糖异构酶的表达及通过驯化提高木糖利用密码子优化的木糖异构酶基因转化到 YRL002 中并在 GAPDH 启动子的控制下表达，获得的菌株命名为 YRL003 (表 2)， 尽管 YRL003 利用木糖的能力比出发菌株 YRL002 好一些，但是利用木糖生长的能力仍然很弱(图 1A, B)。因此，将 YRL003 在含有 casamino acid和木糖的 SD 培养基中进行驯化。通过 32 轮驯化获得了对木糖的利用能力大幅提高的菌株。在进行 32 轮驯化之后，获得了一个能够很好的利用木糖的菌株，命名为 K. marxian
32、usYRL005 (表 2) (图 1A, B). 在 SD 培养基中，37oC 下，它能够生长到 OD600 1.4 (图 1A)；在YPX 培养基中, 42 oC 下， K. marxianus YRL005 能够在 30h 内长到 OD600 16，而双敲除株YRL002 和驯化前菌株 YRL003 的生长非常弱(图 1A, B)。木糖异构酶在这几个菌株细胞中的表达通过测木糖异构酶活力进行了测定。在培养 48h 后， K. marxianus YHJ010, YRL002,YRL003 and YRL005 分别是 0.0017, 0.0013, 0.056, and 0.25 U/mg
33、。这些木糖异构酶活力与各菌株的生长一致。尽管 YHJ010 也能很好的利用木糖生长，但它是通过木糖还原酶木糖醇脱氢酶路径，所以木糖异构酶的活力很弱。与 YHJ010 和 YRL002 相比，YRL003 中的木糖异构酶活力提高了几十倍，但是仍然不能够维持该菌株利用木糖生长。 而 YRL005，它的木糖异构酶活力又比 YRL003 提高了 4.5 倍，从而使该菌株能够利用木糖生长的很好。所以可以说驯化过程就是提高木糖异构酶表达的过程，如果能够直接使木糖异构酶有足够高的表达，则不需要驯化过程。在 YPX 培养基中， YRL005 能够以 0.066 g xylose /g biomass/ h 的
34、速率利用木糖。尽管YHJ0101 利用木糖的速率可以达到 0.058 g xylose/g biomass/h，但是有 1.67g/l 的木糖醇积累(图 1C)。这说明在 YRL005 中，木糖异构酶已经成功替代木糖还原酶和木糖醇脱氢酶进行木糖代谢。-6-215 图 1 K. marxianus 菌株利用木糖在好氧条件下的生长。 A.在 SD 培养基中 37oC 下的生长；B. 在 YPX 培养o o oFig. 1 The Growth of K. marxianus strains with xylose as carbon source under aerobic condition.
35、A. Growth inliquid SD medium at 37oC; B. Growth in YPX medium at 42oC; C. Xylose consummation and xylitol formation at42oC; D. Growth in YPX medium at 45oC.220在 45oC 下也对各个菌株利用木糖生长进行了测定(图 1D)。K. marxianus YH010 能够在30h 内长到 OD600 9.12，但是 YRL005 在最初的 48 h 生长很慢。在 48h 之后，YRL005 开始生长，并在 24h 内生长至 OD600 9.01
36、。为了找出生长延迟的原因，在 19 h (延迟期)、52 h、58 h (对数期) 、72 h and 96 h (平台期)，对 YRL005 细胞中的木糖异构酶活力进行了测定，225230235分别是 0.02 U/mg、0.068 U/mg、0.17 U/mg、0.18 U/mg 和 0.14 U/mg (图 1D)。木糖异构酶活力的变化与生长速率一致，所以生长的延迟是由于木糖异构酶表达的延迟造成的。在将天然的 XR 替换成 GAPDH 启动子控制下的 Pichia stipitis XR 时也有类似现象。而 XI 表达延迟的原因可能是由于在 45oC，GAPDH 启动子转录的延迟。 Ko
37、ndo 研究组也报告由 GAPDH启动子控制的脂肪酶表达时也发现随着温度上升，表达下降27 , 但是这个假定需要对这个启动子进行进一步研究。2.3 木糖发酵为了检测木糖发酵能力，K. marxianus YHJ010, YRL002, YRL003, YRL005 按照材料与方法中描述的那样在密闭的瓶子中培养。 YRL002 和 YRL003 几乎不能利用木糖，也不产生乙醇(图 2A)。尽管 K. marxianus YHJ010 在好氧条件下能够很好的利用木糖（图. 1D），但是其在厌氧条件下利用木糖能力大幅度下降，最终只利用了 1.47 g/l 木糖，产生 1.2 g/l基中， 42 C
38、下的生长； C. 在 42 C 木糖的消耗和木糖醇的产生； D. 在 YPX 培养基中， 45 C 下的生长-7-xylitol ，没有乙醇产生(图 2A)。 这个结果与之前报道的微氧条件下由于木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅酶偏好性不同导致还原力不平衡，最终使木糖利用受阻的结果一致。而 K.marxianus YRL005 能够利用木糖发酵。在 7 天内，利用 17.474 g/l 产生 6.83 g/l 乙醇， 乙醇产率为 0.026 g/ l/ h (图 2A)。尽管有乙酸产生，但是量很少，到第 7 天，仅产生 0.036 g/l 乙240245250255酸。为了测试在更高浓度木糖条件下的
39、发酵状况，在 42oC，对 5% 的木糖进行了发酵。结果显示随着木糖浓度的上升，得到乙醇量也上升。 K. marxianus YRL005 在 7 天内消耗 30.15g/l 木糖产生 11.52 g/l 乙醇，产率达 0.069 g/l/h (表 3, 图 2B)，同样没有检测到木糖醇和甘油的积累。尽管高浓度的木糖能够产生更多的乙醇，但是副产物乙酸的产量仍然保持很低。与2%木糖发酵情况相似，直到第 7 天，仅产生了 0.063 g/l 乙酸。图 2 在 42oC 进行木糖发酵。 各个菌株以 2%木糖为碳源进行发酵（A）；K. marxianus YRL005 以 5%木糖为碳源（B）或以 2
40、%葡萄糖及 5%木糖为碳源（C）进行发酵。Fig. 2. Fermentation with xylose at 42oC. Fermentation ability of each strain with 2% xylose (A); fermentationability of K. marxianus YRL005 with 5% xylose (B) or mixture of 2% glucose and 5% xylose (C) were determined.葡萄糖与木糖的共发酵在采用生物质来源的糖类为底物进行的大规模乙醇生产中很有优势， 所以本研究进行了 2%葡萄糖和 5%木
41、糖的共发酵测试。在 42oC，七天的发酵产生了20.35 g/l 的乙醇。其中 8 小时就消耗了 19.07g 葡萄糖，产生了 8.03 g/l 的乙醇(图 2C)。但是在这期间，木糖几乎没有被利用。尽管在葡萄糖消耗完以后，木糖开始消耗，但是速度要比葡萄糖慢得多（图 2C）。在之后的 7 天发酵中 31.10 g/l 木糖被消耗，产生了 12.13 g/l 乙醇，产生速率为 0.075 g/l/h (图 2C)。这比单纯的木糖发酵要高一些。乙酸在第 8h 开始产生，但浓度一直很低（第 7 天为 0.068 g/l），所以混合糖发酵并不提高副产物乙酸的产量。与以前的报道相似，K. marxian
42、us YRL005 的共发酵过程分两阶段，即在葡萄糖快速的消耗后，木260 糖才开始消耗。这种木糖发酵的延迟可能是由于葡萄糖的抑制效应造成的31, 32中，尽管木糖异构酶由组成型启动子（GAPDH 启动子）控制，但是木酮糖激酶，木糖转运。在本研究-8-蛋白及下游的木糖代谢的基因表达可能还是会受到葡萄糖抑制效应的影响。要构建木糖和葡萄糖同时利用的菌株，可以通过基因工程改造这些基因的表达，例如修改和改变启动子，删除或弱化葡萄糖抑制子等33。265表 3 各种 K. marxianu 菌株木糖消耗及乙醇发酵的比较Table 3 Comparison of xylose consumption and
43、 ethanol formation among various strains of K. marxianus*Xylose(g/l)Ethanol(g/l)Xyloseconsumed(g/l)Ethanolyield(g/g)Ethanolproductivity(g/l/h)Temperature(oC)Time(h) Reference20 5.6 20 0.28 0.117 35 4810 0.8-1.2 10 0.08-0.12 0.036-0.055 45 2220 2.08 13.61 0.15 0.022 40 9620 0.65 8,68 0.07 0.009 45 72
44、20 5.02 20 0.251 0.056 NA 9020 2.6 20 0.13 0.036 30 7220 2,2 20 0.11 0.046 40 4820 1.2 16 0.06 0.017 50 72282930303132323220 6.74 17.24 0.39 0.046 42 144 This study50 11.52 30.15 0.38 0.069 42 168 This study50 4.16 12.37 0.34 0.057 45 72 This study*If one literature contained several strains, only t
45、he best one was shown here and the fermentation of mixed sugar(glucose and xylose) were not shown.270275280285NA: Not available from literature.同样，在 45oC 也进行了 K. marxianus YRL005 的木糖发酵以测定其在更高温度下的发酵能力。与之前的报道类似 （表 3），在 45oC 的发酵比 42oC 下的弱一些。尽管与其它报道的 K. marxianus 菌株相比，在 45oCK. marxianus YRL005 能够产生更多的乙醇
46、，但是整个发酵只在前 4 天进行。消耗了 16.60 g/l 木糖产生了 5.21g/l 乙醇，得率为 0.31g/g。不过副产物乙酸产量仍然很低，最终仅为 0.037g/l。 但是，在 45 oC 发酵出现了中间产物木酮糖的积累（1.69g/l）(图 3A)。在 45oC 木糖和葡萄糖共发酵中，发酵同样在 4 天后基本停止。在这四天中，消耗了 19.85g/l 葡萄糖和 17.27g/l 木糖，产生了 13.52g/l 的乙醇( 图 3B)。与在 42 oC发酵类似，葡萄糖 19.85g/l 在 8h 内即消耗完毕，产生了 7.97g/l 的乙醇。在葡萄糖消耗完后，又消耗了 17.27g/l
47、 木糖，产生了 5.56g/l 乙醇，得率为 0.31g/g。这与单独木糖发酵类似，但是产率从单独木糖的 0.054g/l/h 提高到了 0.064g/l/h (图 3B)。为了找出发酵在 4 天后停止的原因， 对木糖异构酶粗酶的热稳定性进行了测定。木糖异构酶在 37oC、42oC 、45 oC 保温10 分钟后，残余酶活分别为 95.75%, 83.50%, 67.47%。说明在 45 oC，酶已不太稳定。另外在 37 oC 和 45 oC 培养中的木糖异构酶酶活分别为 0.25 U/mg 和 0.18 U/mg。这说明在 45 oC，木糖异构酶的表达下降，同时热稳定性也下降。所以发酵的停止
48、可能是由于没有足够的木糖异构酶造成的。至于木酮糖的积累则可能是由于 45oC，木酮糖激酶或其下游的酶活力不够造成的。-9-o290295300305310315320为碳源的木糖消耗、木糖醇积累、木酮糖积累和乙醇生产。Fig. 3. Fermentation with xylose as carbon source with K. marxianus YRL005 at45oC. Xylose consummation,xylitol accumulation, xylulose accumulation and ethanol producing with 5% xylose (A) or 2% Glucose and 5%xylose (B) as carbon source.当在酿酒酵母 S. cerevisiae 中构建木糖异构酶路径时，尽管木糖醇脱氢酶已被敲除，但是由于非特
