1、1,短期、亚慢性和慢性毒性作用,2,急性毒性试验的局限性：1.外源性化学物在长期重复染毒时可产生与急性 毒性试验完全不同的毒作用。如：苯2.动物的衰老可影响毒作用的性质和程度3.许多重要疾病均与年龄增长有关,一、概 述,3,分类1. 重复剂量毒性作用（短期）2. 亚慢性毒性作用3. 慢性毒性作用,4,（一）蓄积作用,1.蓄积作用(accumulation)：当外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸收速度（或总量）超过代谢转化和排泄的速度（或总量）时，化学毒物或其代谢物在机体内逐渐增加并贮留，这种现象为化学毒物的蓄积作用。 蓄积作用是发生亚慢性、慢性毒作用的前提,5,2.储存库（depot）：
2、化学毒物容易蓄积的组织和器官称为储存库。机体常见的储存库有血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。如骨骼为铅的储存库。蓄积形式: 原形 代谢产物 结合形式,6,7,8,3.2 功能蓄积（functional accumulation）：化学毒物反复多次染毒实验动物后，机体内虽不能检出化学毒物，然而机体可以出现慢性中毒现象。注：功能蓄积是损害效应累计的结果。也可能是由于存留的化学毒物或代谢物数量极微，目前技术方法尚不能检出的一种物质蓄积，或者物质蓄积与功能蓄积兼而有之,9,（二）蓄积作用的意义,毒理学中，评价化学毒物有无蓄积作用， 有助于：1.化学毒物是否引起潜在的慢性毒性依据2.制定卫生限量标
3、准时选择安全系数的一 种依据,10,（三）蓄积作用的研究方法,1、蓄积系数法（accumulation coefficient）2、生物半减期法（biological half-life, t1/2）,11,1 蓄积系数法,1.1 蓄积系数法：以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应（或死亡）进行比较K是指多次接触达到预期效应的累计剂量与一次接触能出现相同效应剂量的比值。 K=ED50（n）/ED50(1)如果以动物死亡一半为效应指标，则K=LD50（n）/LD50(1),12,K值越小：表示化学物的蓄积性越大 K=5 化合物蓄积性弱,13,
4、蓄积系数分级标准,14,1.2 蓄积系数法常用试验方案,A 固定剂量法B 剂量递增法 C 剂量固定的20天蓄积法,15,A 固定剂量法,在事先求出毒物的LD50的前提下，选取相同条件的40只（或更多）动物，随即分为2组：实验组和对照组。每组至少20只，雌雄各半。在1/201/5LD50 之间选择一个固定剂量，每日固定剂量、定时和相同途径染毒试验组累计发生一半动物死亡。如接触剂量已累计达5个LD50，也可终止。实验期限最短为25天（1/5LD50），最长100天（1/20LD50）,16,常用大鼠或小鼠染毒途径多用灌胃或者腹腔注射,17,B 剂量递增法,动物及分组：常用大或小鼠，40（或更多）分
5、染毒组和对照组，每组至少20只，雌雄各半。 终止时间：试验组累计发生一半动物死亡。在第21天也可结束，因累计剂量已达5.26 LD50。,18,C 剂量递增20天法：,动物分组：1/20 LD50、1/10LD50、1/5 LD50、1/2LD50和对照组5个组，每组10只，雌雄各半。 每日染毒一次，连续20天评定标准：（1）各剂量组均无死亡，蓄积性不明显；（2）仅1/2 LD50剂量组有死亡，其他组无死亡，则为弱蓄积性；（3）若1/20 LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系，则为中等蓄积性；（4）若1/20 LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,19,1.4
6、 局限性,1.对于具有免疫毒性的物质不适用2.不能判断化学毒物的蓄积是物质蓄积或功能蓄积 3.蓄积系数法，以死亡为指标，用LD50表示生物效应，有急性试验的局限性，可能漏检某些指标。,20,2、生物半减期法,是利用毒物动力学原理阐明化学毒物在机体内的蓄积作用特征。原理：机体内蓄积的速度和量与单位时间内吸收该物质的速度和量，以及清除的速度和量有关。t1/2反映物质从机体内清除速度的参数，理论上，在等间距离接触下，6个生物半减期即可达极限值98.4%。,21,t1/2越大，在机体内蓄积的可能性越大 t1/2越小，到达极限的时间越短蓄积极限值1.44t1/2每日接触量,22,（二） 基本概念,23,
7、1. 短期重复剂量毒性指实验动物或人连续接触外源化学物14-30 天所产生的中毒效应。,24,2.亚慢性毒性（subchronic toxicity ）： 是指人或实验动物连续较长期接触某一外源化学毒物所出现的中毒效应。一般在相当于1/10左右生命时间（寿命）内亚慢性毒性试验：指在实验动物的1/10左右（如大鼠 3个月）的生命时间内，反复多次给予低剂量化学毒物，观察试验动物有无引起有害作用的试验过程。,25,3. 慢性毒性（chronic toxicity）：是指人或实验动物长期（甚至终生）反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。一般2年慢性毒性试验：在受试动物生命的大部分或终生，连续长期给
8、予低剂量的受试物，观察有无引起有害作用的试验过程。,26,27,试验目的,1. 观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用 特点和靶器官；了解其毒性机制。2. 观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性,28,可逆毒性: 是指停止接触后可逐渐消失的毒性作用。一般情况下，机体接触毒物的浓度越低、时间越短、损伤越轻，则脱离接触后其毒性作用消失的越快。 不可逆毒性是指停止接触后其毒性作用依然存在甚至对机体造成的损害作用进一步加深。 注： 一种毒物引起的组织病理学损伤，其再生能力在很大程度上决定于毒性效应的可逆和不可逆性 有些毒物所造成的损害是不可逆的，如损伤中枢神经系统多数是不可逆的，因为已分化的中枢神经细胞不能
9、再分裂,29,4. 确定不同动物对受试物的毒效应的差异，为将研究结果外推到人提供依据。,3. 研究重复接触受试物毒性作用的剂量-反应 （效应）关系，从初步了解到确定未观察到有害作用 的剂量（NOAEL）和观察到有害作用的最小剂量 （LOAEL），为制定人类接触的安全限量提供参考值,30,二、研究方法,（一）实验设计,31,1 实验动物选择,（1）物种和品系,32,急性原则：* 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物；* 易于饲养管理、试验操作方便的动物；* 繁殖生育能力较强，数量较大能够保障供应；* 价格较低，易与获得的动物。,亚慢性原则：* 理论上，选取对化学毒物代谢过程、生理反应和生化特性基本
10、上与人接近，且在急性试验中证明是对化学毒物敏感的物种和品系实际上，常用大鼠 犬 豚鼠,33,（2）性别、年龄和数量雌雄各半；刚断乳的动物：大鼠68周龄（80-100g），同组动物体重不超过10%、组间平均体重不超过5%大鼠、小鼠每组不少于20只，犬、猴不少于6只，要求试验结束时，活的动物数能保证统计学处理。,34,亚慢性毒性试验年龄：大鼠80100g狗 812月小鼠1015g 数量：小动物20大动物6 性别：雌雄各半,慢性毒性试验 年龄：大鼠 5070g狗 8月小鼠 初断乳 数量：小动物40大动物8 性别：雌雄各半,35,（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境,应选择清洁级及以上等级动物 动物室
11、：清洁、温度22oC3，湿度30-70%，人工控制昼夜交替笼具：大小适中、动物能自由活动饲料：营养合理饮用水：清洁、充足,36,2 染毒方式与期限,染毒方式原则：1）尽量选用与人群实际接触相同的途径和方式食品、药品、环境污染物2）并与预期进行慢性毒性试验的接触途径一致。一般以经口、经呼吸道和经皮肤三种途径 染毒，每日一次，连续给予,37,工业毒理学 36个月 食品毒理学 6个月1年 环境毒理学 6个月1年 致癌试验 接近或等于动物的预期寿命,38,注意的问题： （1）小动物：灌胃或喂饲法大动物：胶囊法或灌胃法 喂饲法注意：混合均匀受试物稳定保证营养 受试物掺入量严格规定,39,（2）呼吸道染毒
12、染毒时间：2-6h/d 亚慢性：4小时慢性试验：间歇性：工业毒物 6-8小时连续性：环境接触 22-24小时,40,（3）注射（4）最好结合毒物动力学血药浓度的监测， 以保持生物学效应的每日相似性,41,3 剂量选择和分组,（1）分组：原则：一般设3个试验组和1个阴性（溶剂）对照组。最高剂量组：要求出现明显的中毒症状或某些观察指标发生明显变化，但动物不死亡，即使有死亡，不超过10%最低剂量组：应无中毒反应或极轻微反应（ NOAEL)。中剂量组相：当于观察到有害作用的最低剂量(LOAEL) 高、中、低剂量组距以310倍为宜，不少于2倍,42,（2） 剂量设计：以相同物种的短期毒性资料为依据。 亚
13、慢性毒性试验可依据急性毒性的阈剂量或以1/201/5LD50确定；慢性毒性试验以亚慢性毒性试验效应的最大耐受量（MTD）为最高剂量。剂量选择步骤：急性 亚急性 亚慢性 慢性,43,对于人群主动摄入的食品和药品，可采用人 体可能接触的最高剂量为剂量设计依据大 鼠： 3个剂量组：10 30 100非啮齿类： 3个剂量组：5 15 50,根据专业特殊性和管理部门有所区别,44,亚慢性毒性的剂量选择 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组急性毒性的阈剂量1/201/5 LD50 组距：310倍，最低不小于2倍,慢性毒性的剂量选择 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组亚慢性阈剂量或其1/51/21
14、/10 LD50 组距：25倍，最低不小于2倍,45,4 观察指标,46,（1）一般观察,1）进食量、外观体征、行为活动综合性指标初步判断作用部位、损害程度,47,2）动物体重：体重的增长情况是综合反映动物健康状况最基本的灵敏指标之一，受食欲、消化功能、代谢和能量消化变化的影响。如发现实验组动物体重增长减慢，停止或减轻，在排除由于异味引起食欲不佳的前提下，可说明化学毒物的毒性效应。表示方法：（1）体重绝对增长量（2）体重增长百分率（10）（3）剂量-反应关系,48,3）饲料消耗量：食物利用率：动物每摄入100g饲料所增长的体重克数（g体重/100g饲料）评价：食物利用率有助于了解化合物毒性效应
15、观察内容：影响食欲影响食物的吸收、代谢食物利用率体重增长/进食量,49,（2）实验室监测项目血、尿常规和血液生化指标目的：发现受试物所致器官损伤和器官紊乱检查重点：肝脏、肾脏、血液,50,1）血液学检查包括红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数 及分类、凝血时间等 2）血液生化检查（针对肝脏、肾脏及相关可能靶部 位选择）注：一般只需在实际结束后处死动物采血检验如需在实验过程中采集血样，最大采血量不能 超过总血量的10% 3）尿液,51,（3）系统尸解和组织病理学1）脏器重量和脏器系数：脏器系数（比）：指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量。在不同的年龄期，实验动
16、物各个脏器与体重比值有一定规律，若化学毒物使某个脏器受损，其比值会发生变化，是一项灵敏、有效和经济的指标。,52,脏器系数增大：增生、充血、水肿脏器系数减小：脏器发育不良、萎缩,53,尸解对象： 实验过程中死亡的或者试验结束后未死亡的观察的主要脏器：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、卵巢（睾丸）、脑等,54,2）病理学检查,目的：确定化合物对毒作用的靶部位，损伤的性质和程度，从病理学角度寻找化学毒物与病理改变的剂量效应关系，为了解化合物的毒效应及机制提供依据。检查内容：大体检查、常规病理组织学检查、酶组织化学化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查。,55,常规病理组织学检查,HE染色原理：苏木
17、素-伊红染色，又叫常规染色和普通染色。主要用来显示各种组织正常成分和病变的一般形态，进行总体观察。,56,免疫组织化学法,间接免疫荧光法亲合素-生物素技术,57,间接免疫荧光法原理,抗原与一抗结合和，再用标记荧光色素 的二抗与第一抗结合，在荧光显微镜下发出 荧光来间接显现抗原。,58,59,亲合素-生物素技术原理,亲合素又称卵蛋白素，是从卵蛋白中提 取的一种糖蛋白，每个亲合素上有4个与生物 素分子结合力极高的位点，两者间的亲和力 比抗原抗体大100万倍。第二抗体结合上生物 素，变为生物素化抗体。再将亲合素与过氧 化酶标生物素结合在一起，形成亲合素-生物 素-过氧化物酶复合物（ABC复合物）。,
18、60,亲合素-生物素技术,61,62,（4）可逆性检查最后一次给药后24h，每组活杀部分动物（如2/3），检测各项指标，余下动物停止染毒，继续观察2-4周。重点观察毒性反应器官，以了解毒性反应的可逆性和可能出现的迟缓性毒性,63,（5）指标观察时间一般状况和症状，每天观察一次每周记录饲料消耗量和动物体重各一次实验时间3个月实验时间3个月,64,（6）特异性指标及其它特异性指标是指能反映毒物对机体毒作用本质的 特征性指标，常与其毒作用机制有关，有时可作为效 应生物学标志。对神经行为的检查 神经系统心电图、血压 心血管系统,65,（二）长期毒性试验的注意事项,66,重视实验项目管理合理的实验设计剂
19、量设置合理获得明确的剂量-反应关系，理想的NOAEL、LOAEL,67,3.试验动物环境的要求4.检测条件的控制,68,三、结果评价（一）明确观察指标是否有差异1. 剂量相关性分析2. 反应重现性,69,3. 相关指标的变化4. 差异大小和性别差异5. 历史性对照的作用,70,（二）差异是否代表有害效应,71,化学品毒性鉴定程序和方法,1）第一阶段（急性毒性试验、眼刺激试验和皮肤刺激试验） 主要是急性毒性参数的测定和了解受试样品对皮肤、粘膜的刺激性以及致敏性，为毒性分级和标签管理提供依据。同时，可了解受试样品对机体造成急性损害的可能性和严重程度，并为第二阶段各项试验的剂量设计提供依据。在测定L
20、D50时，一般要求用两种动物，染毒途径应包括所有人体可能的接触途径。,72,2）第二阶段（亚急性毒性试验和致突变试验） 主要是了解受试样品的亚急性毒性和遗传毒性，为第三阶段各项试验剂量设计和观察指标的选择提供依据，并对受试样品的致癌性进行预测。 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验） 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验 哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验，或 精子畸形试验 啮齿类动物显性致死试验 免疫毒性评价试验方法,73,3）第三阶段（亚慢性毒性试验、致畸试验、繁殖试验） 通过亚慢性试验进一步确定多次重复染毒
21、的毒作用性质和靶器官，初步确定NOAEL或LOAEL，为第四阶段各项试验的剂量设计和观察指标的选择提供依据；通过致畸试验判断受试样品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通过繁殖试验，可判断受试样品对生殖过程的损害作用。通过迟发性神经毒性试验，可判断受试样品是否具有迟发性神经毒作用。 亚慢性吸入毒性试验 亚慢性经皮毒性试验 亚慢性经口毒性试验 致畸试验 两代繁殖毒性试验 迟发性神经毒性试验,74,4）第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验） 通过慢性毒性试验可确定受试样品的NOAEL和LOAEL，为推算受试样品的安全接触限值提供依据。通过致癌试验可以确定受试样品对受试实验动物的致癌性。通过代谢动力学试验可以了解受试样品的吸收、分布、代谢和排泄特点，了解蓄积毒性作用及其可能的靶器官和毒作用机理。 慢性吸入毒性试验 慢性经皮毒性试验 慢性经口毒性试验 致癌试验或慢性毒性试验合并致癌试验 毒物代谢动力学试验,75,The end,
