1、法尼酯 X 受体对肝脂酶表达及活性的影响重庆医学 2007 年 11 月第 36 卷第 2l 期?论着?法尼酯 X 受体对肝脂酶表达及活性的影响2l69中丽丽,彭家和,刘红,甘淋,鲁立,张迁,江渝(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室,重庆 400038)摘要:目的探讨法尼酯 x 受体(farnesoidXreceptor,FXR)对肝脂酶(hepaticlipase,HI)表达及活性的影响.方法用FXR 激动剂 CDCA 作用人肝癌细胞株 (HepG2),用 RTPCR 和 Westernblotting检测 HL 的表达情况.此外,用 FXR 激动剂CDCA 处理 C57BL/6 小鼠,
2、采用总脂酶测试盒检测 HI 的活性.结果用不同浓度的CDCA(25,50,75gmol/L)分别作用 HepG2细胞,6,l2,24,48h 后 HI 的 mRNA 和蛋白质水平呈时间和剂量依赖性下调 .同时,用不同浓度的 FXR 激动剂 CDCA(10,20,5O,9O,l50mg/kg)处理 C57BI/6 小鼠 7d 后,测定小鼠 HI 的活性呈剂量依赖性下降.结论 FXR 激动剂可抑制肝脂酶的表达及活性.关键词:法尼酯 X 受体;肝脂酶;动脉粥样硬化;甘油三酯; 胆汁酸中图分类号:R446.112;R541.4 文献标识码:A 文章编号:l6718348(2007)21-216903E
3、ffectsoffarnesoidXreceptorontheexpressionandactivityofhepaticlipaseSHENLiLi,PENGjiaHe,GANLin,eta1.(Department0_,BiochemistryandMolecularBiology,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofthefarnesoidXreceptoronhepaticlipaseexpressionandactivity.
4、MethodsHumanhepatoblastomaHepG2cellsweretreatedwithchenodeoxycholicacidandthelevelsofHImessengerRNAandproteinweredeterminedbyusingRTPCRandWesternBlotrespectively.Besides,C57BL/6mousesweretreatedwithCDCAandtheaetivityofHIweredeterminedbyusingtotallipidstestbox.ResultsHepG2cellsweretreatedwithFXRagoni
5、stsCDCAwithdifferentconcentrationsof25gmol/I,50gmol/I,75gmol/Ifor6,12,24and48hrs,respectivtlyandthelevelsofHLweredecreasedwithdoseandtimeinbothmessengerRNAandprotein,Meanwhile,C57BL/6weretreatedwithFXRagonistsCDCAwithdifferentconcentrationsof10mg/kg,20mg/kg,50mg/kg,90mg/kg,150mg/k9forsevendays,andth
6、elevelsofHLweredecreasedwithdose,ConclusionFXRagonistdecreaseshepatic1ipaseexpression.Keywords:thefarnesoidXreceptor;hepaticlipase;atherosclerosis;TG;acidbile动脉粥样硬化(atherosc1erosis,AS)是常见的心脑血管疾病,其形成中与甘油三酯(triglyceride,TG)的增高密切相关.现已明确高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)是引起冠心病(coronaryheartdisease,CHD)的独立危险因
7、素.法尼酯受体(farnesoidXreceptor,FXR)是孤儿核受体超家族中的一员,在胆汁酸,甘油三酯代谢,胆固醇代谢中发挥重要作用.因此 ,研究 FXR 对甘油三酯合成代谢的调节及防治 AS有重要意义.FXR 又称胆汁酸受体,可被内源性配体胆汁酸激活,在肝脏,肾脏和小肠等组织中高表达3“,可以与视黄醇 x 受体(RXR)形成异二聚体后与靶基因的 FXR 反应元件(FXRresponseelement,FXRE)结合发挥转录调节作用 .肝脂酶 (hepaticlipase,HI)是一种糖蛋白,主要由肝脏实质细胞合成和分泌.它具有两种生物功能:(1)具有脂酶活性,水解各种脂蛋白中的甘油三酯
8、和磷脂,使脂蛋白颗粒的大小和密度发生变化;(2)作为配体促进摄取高密度脂蛋白(HDL) 中的胆固醇或低密度脂蛋白(LDI)残粒,促进肝细胞摄取含载脂蛋白(apo)B类脂蛋白,此功能影响着血浆中脂蛋白的浓度.大量流行病学调查表明,HL 合成,分布,活性的变化和动脉粥样硬化密切相关.HI 遗传缺陷患者血浆中 HDL 胆固醇和磷脂的水平显着增加.本研究以肝脂酶为研究对象,观察 FXR 激动剂对其表达的影响.1 材料与方法1.1 材料和试剂 HepG2 人肝癌细胞株由本室提供 ,C57BL/6 小鼠(由第三军医大学实验动物中心提供).主要试剂:DMEM 高糖培养基(HyClone 公司);CDCA(c
9、henodeoxycholicacid)(Sigma 公司);Tripure 试剂(Roche 公司);一步法RTPCR 试剂盒(Promega 公司);鼠抗人 HL 单克隆抗体 (美国 SantaCruz 公司);辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(广州中杉公司);总脂酶( 脂蛋白脂酶 /肝脂酶)测试盒( 南京建成生物工程研究所);其余试剂均为国产分析纯.1.2 细胞培养 HepG2 细胞株采用含 lO 胎牛血清的DMEM 高糖培养基于 37,5 的 CO 温箱内培养.2 4d 更换培养基 1 次,取对数生长期细胞进行实验.按文献所述,细胞以 0.510/孔密度接种至 6 孔细胞培养板中,每孔加培
10、养液为 2ml 左右,逐孔加人 CDCA(75gmol/L),分别于加 CD 一基金项目:第三军医大学留学回国人员启动基金(2006 年度); 重庆市自然科学基金计划项目(2007BB5050).共同第 1 作者;通讯作者:Email:yujiang61gmail.corn217OCA6,l2,24,48h 后收集细胞;其次是加入 CDCA,设 3 个剂量,分别是 25,5O,75tmol/l 作用 48h 后收集细胞,一 2O冻存.1.3 验动物 C57BI/6 小鼠,雌性,46 周,1820g,清洁级饲养.本实验以 C57BI/6 小鼠作为实验动物模型.将健康C57BI/6 小鼠随机分为两
11、组:正常对照组和实验组.实验组按照 CDCA 灌胃的剂量不同又分为 5 组,共 5 组动物,每组 5只.实验组给予 CDCA 的剂量依次为:1O,2O,5O,9O,150mg/kg;对照组给予相同剂量的酒精灌胃处理.7d 后眼眶取血处死,取新鲜肝组织,液氮保存.1.3RTPCRHI 和 8 一 actin 的引物使用 PrimerPremier5.0自行设计,HI 和-actin 的引物由上海英骏公司合成.序列为:HI 上游引物 5 一 TCAATCATCCGGACACGTTA 一 3,下游引物:5r_CTCCCGCGTAAAGGTATGAA 一 3,扩增产物片断为 482bp;8 一 act
12、in 上游物 :5I_CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 一3,下游引物:5r_ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 一 3,扩增产物片断为 3o8bp.采用 Tripure 一步提取法(按 Roche 公司说明书)提取细胞总 RNA,然后逆转录为 cDNA.PCR 按照试剂盒说明书进行操作,采用 5Ol 反应体系.PCR 反应条件:94.C 变性 5min 后,9430s,59C30s 和 7230s,顺序循环3O 次,最后 72C 延伸 7min.反应结束后取 PCR 产物 1O“l 以含有 0.5tg/ml 溴化乙锭的 1O 琼脂糖凝胶电泳分离 .将凝胶置于 UVP 凝胶成
13、像系统中扫描,进行图像分析,测出 HI 与-aetin 的吸光度值.1.4Western 蛋白印迹检测蛋白质水平在收集的细胞中加入细胞裂解液进行细胞裂解,于 4离心 10min,弃除沉淀,BAC 法进行蛋白定量 .取 50/g 蛋白加入 5SDS 凝胶加样缓冲液中,在 100.C 加热 5min 使蛋白质变性.用 1OV0SDS 一聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,转 PVDF 膜,丽春红染色观察转移效果,并确定蛋白分子量标准位置.封闭液封闭 2h,按 1:500加入鼠抗人 HI 一抗,4孵育过夜,TBST 洗 3 次.1:5000加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,室温孵育 1h,TBST 洗3 次
14、,用辣根过氧化物酶 HRPECI 发光法显色.暗室内曝光X 线胶片,常规方法显影,定影.用 Quantityone 软件(BioRad)对杂交条带进行定量分析,以蛋白条带吸光度和条带面积的乘积作为代表蛋白表达水平的计量资料.1.5 统计学分析以空白对照条带的灰度值为 1,实验组数据与对照组数据相比取值.实验所有数据采用 i_4-表示 ,组间比较采用方差分析.以 SPSS10.0 软件进行统计学处理,Pd0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1FXR 激动剂 CDCA 下调 HI 的基因表达研究用 CDCA 诱导 HepG2 后,用 RTPCR 检测其 HImRNA 的表达情况.结果表明经
15、CDCA(75“mol/I)处理的 HepG2 细胞 HImRNA 表达明显降低.如图 1 所示,CDCA 明显抑制了 HL的表达,而对照(DMSO 处理后)无明显变化.同样,从 6,12,24,48hCDCA 处理的 HL 与 8 一 actin 的灰度值比值分别从 2.97降到 1.09,其中 24h 和 48h 的 HLmRNA 水平与对照 (DMSO)比较降低程度最为显着,差异有统计学意义(P0.05).同样,用 CDCA(浓度依次为 25,50,75/mol/I)处理HepG2 细胞 48h 后,随着剂量的增大 HImRNA 水平也有明重庆医学 2007 年 11 月第 36 卷第
16、21 期显的下降,如图 2 的 A 图所示.2.2FXR 激动剂对 HepG2 细胞 HI 蛋白质表达的影响如图 3 所示,HepG2 细胞 CDCA(75/mol/I)处理 6,12,24h 和48h 后,提取细胞总蛋白质经 Western 蛋白印迹检测发现 HI蛋白质表达也受到明显抑制,蛋白质水平的结果与 HImRNA表达水平相一致,而 DMs()处理的细胞却无明显变化.“aA50 呻25aM 抽 l2hh48h75 叶B呻啦 l_-.c:0 呷5 呻(A)加入 CDCA(75/,mol/I)6,12,24,48h 后 HImRNA(从左至右);(B)加入 DMS()6,l2,24,48h
17、 后 HImRNA(从左至右);(C) 与 A相对应的l-actin(75p.mol/l)6,12,24,48h 后 Bactin.M 为DI2000Marker.与 DMS()比较,:P0.05.图 1CDCA 对 HImRNA 水平表达的影响A7 脚蛳2 脚50 呻B25 晦 r48 曲 pB-h30g(A)l,2,3,4,5 分别是加入 DMS(),CDCA0,25,50mol/l 和75p.mol/148h 后 HImRNA.(B)与 A 相对应的 Bactin.与 DMSO比较,;P0.05;M 为 DI2000Marker.图 2CDCA 对 HImRNA 水平的影响6hlmA 赫
18、赫镕*B舡57/t/ljhC_-自_嘲_嘲霸_蝴 eactin帕 l(A)加入 CDCA6,12,24h 和 48h 后 HI 的蛋白表达(从左到右).(B)加入 DMS()6,12,24h 和 48h 后 HI 的蛋白表达(从左到右)(c)加入 CDCA6,12,24h 和 48h 后与 A 相对应的 Bactin.图 3CDCA 对 HI 蛋白质水平的诱导2.3FXR 激动剂对 C57BI/6 小鼠 HI 酶活性的影响C57BI/6 小鼠灌胃处理 7d 后,取新鲜肝组织.采用总脂酶(脂蛋白脂酶/肝脂酶) 测试盒 ,测定 HL 酶的活性随着 CDCA剂量的增大呈下降趋势,HI 酶的活性受到明
19、显抑制,其中在CDCA 的剂量在 10,90,120mg/kg 时最为显着.而对照组却无明显变化.3 讨论重庆医学 2007 年 11 月第 36 卷第 21 期目前,研究已经证实 FXR 参与调控甘油三酯代谢,发现FXR 基因敲除小鼠血浆甘油三酯含量增高.FXR 对血浆和肝脏甘油三酯的调节主要通过 2 个途径:(1)降解血浆中的甘油三酯,主要通过调控与其代谢密切相关的酶类以及一些重要脂蛋白和相应受体的表达来发挥作用.如 FXR 可诱导 Syndecan 一 1(SDC1)的转录,降低血浆甘油三酯:.SDC1 是跨膜的乙酰肝素硫酸盐蛋白聚糖的家族成员,通过脂蛋白脂肪酶,apoE 等桥蛋白与脂蛋
20、白相连,在肝脏清除脂蛋白残粒中发挥作用.(2)抑制肝脏合成新的脂肪.FXR 由胆汁酸激活后可激活小异二聚体伴侣分子(smallheterodimerpartner,SHP) 的表达,SHP 是一种抑制性核受体,可通过抑制肝 x 受体(1iverXreceptors,IXR)的激活而下调甾醇调节元件结合蛋白 1c(sterolregulatoryelementbindingproteins,SREBP-1c)的表达,最终使血浆中 TG 含量减少.SREBP 一 1 负责调控脂肪合成相关基因的表达,在肝脏合成新的脂肪中发挥重要的作用.本研究结果发现,当不同浓度的 FXR 激动剂作用于HepG2 细
21、胞后 ,HI 在 mRNA 水平和蛋白质水平上都有明显的下调.在 mRNA 水平上,相同剂量的 CDCA 处理的 HIA8h和 6h 相比其 mRNA 水平有很大程度的降低,其抑制程度和CDCA 的剂量呈量效关系,二者呈负相关.同样,在蛋白质水平上也出现类同的现象.此外,动物实验证实 C57BI/6 小鼠HI 酶活性也受到明显抑制.推测机制可能是通过降解血浆中的甘油三酯这条途径来发挥作用.活化的 FXR 诱导 SDC1转录,SDC1 通过 HI 与脂蛋白相连,清除肝脏中的脂蛋白残粒,降低血浆中的甘油三酯.同时,FXR 对脂质的调节还表现在对 HDI 代谢的调节.HDI 是胆固醇逆向转运中的核心
22、分子,负责把外周组织的胆固醇转运回肝.研究认为血浆高水平HDI 可抗动脉粥样硬化,这可能部分是由于其主要蛋白质apoA.所介导的 .apoA 为外周组织胆固醇的初级接受体,参与催化胆固醇酯的生成,为 HDI 蛋白成分.研究表明,FXR是 apoA.表达的负性调节因子,它与人 apoA.启动子上的FXR 负性反应元件结合阻遏 apoA.的转录.FXR 也可通过对HDL 循环代谢中的酶和受体分子的调控,间接调节 HDI 体内水平.FXR 基因敲除小鼠,血浆 HDI 以及 apoA.水平大幅度升高.本研究中 FXR 对 HI 的调节就是 FXR 通过对 HDI循环代谢中的酶的调控,间接调节 HDI
23、体内水平.本研究还发现,由于 FXR 诱导小异二聚体伴侣分子(smallheterodimerpartner,SHP)的表达发生的比较早 ,所以FXR 对 HI 转录水平的调节受到很大的延迟,与文献报道的FXR 对其靶基因 UGT2B4 和 apoAI 的调节是一致的“.也有文献报道 FXR 可能是通过别的途径间接调节 HI 的转录水平 u,可能是因为胆汁酸还独立参与调节其他的信号转导途径.但具体机制仍不确定,还需要进一步研究.由此可见,FXR 对脂质代谢的调控发挥重要的作用.随着对 FXR 研究的不断深入,配体的发现,靶基因的鉴定和FXR 基因敲除小鼠的应用1,FXR 已成为治疗血脂代谢异常
24、,动脉粥样硬化等疾病的新靶点.通过本研究我们可以推断HI 可能是 FXR 作用于人肝脏的一个新的靶基因,但 FXR 调节 HI 的作用机制还需要进一步了解.这可能是胆汁酸在人2171肝细胞中调节甘油三酯和 HDI 代谢的一个新机制,也可能成为 FXR 作用于 HDI 代谢的一个新通路.通过这种机制和通路,可以寻找到治疗 AS 的新药物和手段.这对于调节脂代谢异常和动脉粥样硬化的防治具有重要意义.因而作者下一步除了对 FXR 调控 HI 的机制深入研究外,还可以考虑进行动物模型实验以验证 FXR 作为药物的靶点发挥抗 AS 的作用.参考文献:1NakamuraT,KugiyamaK.Trigly
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26、ofcholesterolandbileacidmetabolismbynuclearreceptorsEJ.JPharmacolSci,2005,97(2):177.4RizzoG,RengaB,MencarelliA,eta1.RoleofFXRinregulatingbileacidhomeostasisandrelevanceforhumandiseasesEJ.CurrDrugTargetsImmuneEndocrMetabolDisord,2005,5(3):289.53Audrey,Sirvent,AdrieJM,eta1.FarnesoidXreceptorrepressesh
27、epaticlipasegeneexpressionEJ.JLipidRes,2004,459(2):2110.6AngelinBEK,HellstromK,I.eijdB.EffectsofcholestyramineandchenodeoxychohcacidonthemetabolismofendogenoustriglycerideinhyperlipoproteinemiaJ.JLipidRes,1978,19(3):1017.E7KastHR,NguyenCM.SinaiCJ,eta1.FarnesoidXactivatedreceptorinducesapolipoprotein
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