1、肝纤灵汤结合利加隆在大鼠实验性肝纤维化中保护作用的研究2009 年第 3O 卷第 lO 期云南中医中药杂志 53肝纤灵汤结合利加隆在大鼠实验性肝纤维化中保护作用的研究岳华,祁宏,查光成,王观秀,王国飞,蔡新和(江苏省建湖县中医医院,江苏建湖 224700)摘要:目的:探讨大鼠实验性肝纤维化(HepaticFibrosis,HF)中肝纤灵汤结合利加隆对肝细胞损伤的保护作用.方法:以四氯化碳(CCh)诱导大鼠肝损伤及 HF 模型,并分别使用利加隆,肝纤灵汤和肝纤灵汤结合利加隆进行肝组织保护,观察肝细胞功能,HF 过程中大鼠肝组织的病理变化并应用免疫组化技术检测 PIIIP,IV 型胶原在肝组织中的
2、分布及放免测定血清型前胶原肽,型胶原含量;测定大鼠血清肝功能指标谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST), 总蛋白(TP),白蛋白 .同时运用 Westernblot 方法检测 PIIIP 胶原.结果:模型组,大鼠注射 CCl4 后,肝细胞变性,坏死,并发生脂质过氧化损伤:肝间质纤维结缔组织增多,形成纤维化 ,;r-管区 ColPIIIP.一含量增多并构成纤维间隔的主要成分; 治疗组,单纯利加隆和肝纤灵汤明显降低 0ck 引起的大鼠肝细胞转氨酶活性.减轻肝细胞坏死及肝组织过氧化损伤,抑制胶原等细胞外基质(Extraeelluarmatrin,ECM)沉积.而肝纤灵汤结合利加隆治疗组明显优于单
3、纯利加隆和肝纤灵汤组.Westernblot 方法检测 PIIIP 胶原在肝纤灵汤结合利加隆治疗组明显低于单纯利加隆和肝纤灵汤组和模型组.结论:肝纤灵汤结合利加隆具有明显抗 HF 的作用,其主要机制可能是:保护肝细胞功能,缓解脂质过氧化造成的损伤,从而调节胶原代谢,抑制(lPIIIP.一 IV 等 ECM 在肝组织沉积.关键词:肝纤雏化;利加隆;肝纤灵汤;Westernblot中图分类号:R575.2 文献标识码:A文章编号:1O072349(2O09)1O 一 0o53 一 O4肝纤维化是指不同病因(如病毒,乙醇,铜铁沉积等)引起慢性肝损伤,以胶原为主的细胞外基质在肝脏内过度沉积的病理过程.
4、本实验用四氯化碳(CCh)诱导大鼠肝损伤及 HF 模型,并以利加隆,肝纤灵汤和肝纤灵汤结合利加隆进行治疗,光镜下病理观察及纤维化分级,检测 PIIIP,IV 型胶原在肝组织中的分布及含量,同时运用 Westernblot 方法检测 PIIIP 胶原含量.测定大鼠血清肝功能指标ALT,AST,TP,A,TB.了解肝纤灵汤结合利加隆对 CCh 鼠肝组织脂质过氧化反应及肝细胞结构的影响,并探讨其作用机制,为临床提供丰富的理论依据.1 实验材料1.1 药品及试剂肝纤灵汤(黄芪 30g,冬虫夏草 10g,炙鳖甲 30g,丹参 20g,桃仁 10g,土茯苓 20g,郁金 15g,虎杖 10g,甘草 15g
5、,由韩国产 99FOREVER 煎药机制成 lOOrnL/袋);利加隆.70mg/caps, 按量捻碎后用生理盐水溶解配成所需浓度(德国马博士大药厂,批号 130802011);m 型前胶原和型胶原放免试剂盒(购于北京东亚放免研究所,批号 032205);免疫组化试剂(购自北京中山生物技术有限公司,批号 020147);碧云天生产的 Western 一抗稀释液(P0023A)二抗稀释液(P0023D),批号 042104;ECL 化学发光试剂(PerkinElmerLifeandAmlyticalSciences,美国),批号 062141.1.2 动物清洁级 SD 大鼠 56 只,体重(22
6、5_-+20)g,雄性 ,南通大学医学院动物实验中心提供,许可证号 SCXK(苏)2002-00192 实验方法2.1 造模及给药方法大鼠随机分为 4 组.(1)模型组(Mo组):50%CCl4 色拉油混合液 0.3mL/100g 皮下注射, 每周 1,5各 1 次;O.9Nael8mL/kg 灌胃,每天 1 次;(2)利加隆组(C1组):利加隆 50mg/kg 灌胃,每天 1 次;50CCh 色拉油混合液 0.3mL/100g 皮下注射,每周 1,5 各 1 次;(3)肝纤灵汤组():50cch 色拉油混合液 0.3mL/100g 皮下注射,每周 2次;中药肝纤灵汤 8mL/kg 灌胃,每天
7、 1 次;(4)肝纤灵汤结合利加隆组(C3 组):色拉油混合液 0.3mL/100g 皮下注射,每周1,5 各 1 次;中药肝纤灵汤 8mL/灌胃,每天早,晚各 1 次;利加隆 50mg/灌胃,每天 1 次.分别于实验第 4,6 周每组随机抽取 7 只动物下腔静脉采血及处死大鼠采集肝活组织标本.2.2 组织学肝组织标本用中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE 染色和 Masson 三色染色,光镜下作病理观察及纤维化分级观察.由同一病理专科医师予以纤维化分级.肝纤维化分级标准1:0 级:无胶原纤维形成;1 级:汇管区扩大,但无纤维组织相连;2 级:汇管区扩大,纤维组织将汇管区相连;3 级: 汇管区之
8、问,汇管区与中央静脉之间出现广泛的纤维连接;4 级:假小叶形成.2.3 血清型前胶原肽,型胶原放免测定各组大鼠下腔静脉采血 3mL,离心后取血清检测型前胶原肽与型胶原,操作按试剂盒说明书进行,依此在对照管,标准品,待测样品管加入蒸溜水,标准品,待测血清,再加入放射性 125I 标记抗体,37孵育 60min,在放免测定仪上读数,根据公式计算ECM 含量 .2.4Westernblot 检测 PmP 型胶原取新鲜标本各100mg,抽提全蛋白,测浓度后7O冻存备用.每孔加样25/L,7.5SDS-PAGE 胶分离蛋白,并转移到 PVDF 膜上,5 去脂奶粉封闭 PVDF 膜,1h 后加入 PmP
9、型胶原抗体孵育 lh,再加入共轭的辣根过氧化物酶二抗,最后用 ECL 化学发光试剂(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,美国)X54 云南中医中药杂志 2009 年第 3O 卷第 lO 期光胶片(放射自显影片) 感光完成分析.2.5 统计学处理结果以均数标准差(s)表示,应用SPSS 软件进行方差分析,纤维化程度计数资料采用秩和检验.3 实验结果3.1 组织学改变肝组织切片 HE 染色和 Masson 三色染色显示:HE 染色显示 Mo 组大鼠肝内正常肝小叶结构被破坏,肝细胞排列紊乱,胞体较大,核大着色较深,可见双核肝细胞.汇管区内结缔组织增生形成条索,伴
10、有不同程度的炎性细胞浸润,而 C2 组,肝组织病变程度较轻,肝小叶结构尚清晰,小叶中央及周围部分肝细胞浊肿,气球样变,脂肪变性,汇管区增大,纤细的纤维组织沿小叶间延伸.Masson 三色染色显示,第 4 周时,Mo 组大鼠汇管区扩大,胶原明显增生 ,形成纤维隔.而 C2 组,大鼠纤维组织增生较轻,纤维隔较为细小,纤维化分级较轻(PO.05).第 6 周时,所有的 Mo 组大鼠均发展为严重的肝纤维化(纤维化分级 3 或 4 级),与之相比,C3 组大鼠肝纤维化程度较轻(PO.05),见表 1,图 18.表 1 各组大鼠肝纤维化分级组别 4 周鼠数 6 周鼠数0 级 1 级 2 级 3 级 4 级
11、合计 0 级 1 级 2 级 3 级 4 级合计Mo 组 014117000257C1 组 232007321107C2 组 322107412107C3 组 610007610007注:Cl 组,C2 组 ,C3 组与 Mo 组比较,P(0.05;C3 组与 C1 组,组比较PO.05图 1 肝纤维化 Mo 组大鼠肝脏 4w 时 HE 染色(HEX10)图 3 肝纤维化 C1 组大鼠肝脏 4w 时 HE 染色(HE10)图 4 肝纤维化 c1 组大鼠肝脏 6w 时 HE 染色(HEX10)图 5 肝纤维化 C3 组大鼠肝脏 6w 时 HE(HE10)图 6 肝纤维化 Mo 组大鼠肝脏 4w
12、时三色染色染色(40X10)圈 2 肝纤维化 Mo 维大鼠肝脏 6w 时 HE 染色(HEX10)图 7 肝纤维化 Mo 组大鼠肝脏 6w 时三色染色(4010)2009 年第 3O 卷第 lO 期云南中医中药杂志 55图 8 肝纤维化 c3 维大鼠肝脏 6w 时三色染色(4O10)3.2 大鼠肝功能的比较(表 2)四氯化碳模型组大鼠血清ALT,AST,A,TB 水平与利加隆组比较差异显着(P0.05),肝纤灵汤结合利加隆干预性治疗可明显降低 ALT,AST,TB水平,提高 A 水平,与 Mo 组比较差异有显着性意义(P0.01),AIT,AST.A 水平与 Mo 组之间差异不显着(P0.05
13、),肝功能改善明显,但肝纤灵汤结合利加隆组大鼠血清AST 水平与 Mo 组比较仍有非常显着性差异(PO.01),反映CC1 注射对大鼠肝脏的毒性损害较重,肝纤灵汤结合利加隆对降低 AST 水平的作用有限,各组大鼠血清总蛋白含量无显着差异(PO.05),与肝纤维化大鼠血清球蛋白(主要是 7 球蛋白)增加 ,A/G 比例倒置,而总蛋白含量变化不显着有关.表 2 实验各组 6w 大鼠肝功能比较(n 一 7.is)与 Mo 组比较,Pd0.05,PO.053.3 血清 PP,型胶原的改变 (表 3)C1,C2,C3 治疗组血清 PP,型胶原低于 Mo(P0.05),C3 治疗组分别与C1,C2 治疗组
14、比较有显着性差异(PO.05).C3 治疗组可显着抑制肝脏合成 ECM 的增加,具有显着抗纤维化作用.表 3 治疗组对 PP 和型胶原的影响 (is)组别 4W6Wl-型胶原鼠数 PP 型胶原C1,c3 分别与 Mo 组比较 P0.05;C3 组与 CI,C2 组比较,.P0.053.4Westernblot 检测 PP 型胶原(图 8)结果显示 PP型胶原在肝纤灵汤结合利加隆组明显低于单纯肝纤灵汤组和利加隆组,而单纯肝纤灵汤和利加隆组明显低于模型组.单纯肝纤灵汤组和利加隆组之间无明显差异.对照模型组肝纤灵利加隆结合组PHIP一actin4 讨论肝纤维化的发病机制是细胞外基质的合成增多,降解减
15、少,使大量 ECM 沉积于肝内.细胞外基质包括胶原,糖蛋白及蛋白多糖等,其中胶原是最主要的成分.肝纤维化的形成过程主要取决于胶原的合成,沉积,降解和吸收的动态平衡.当胶原合成与沉积大于降解和吸收时,肝内胶原纤维增加,逐渐形成肝纤维化.胶原在正常肝组织中只占蛋白成分的 510,但在肝硬化组织中可增高到 50%以上_2,故纤维化血清标志物作为非创伤评定系统主要疗效考核指标需要联合检测 HA(透明质酸), 层粘素(LN),III 型前胶原肽(PIIIP),型胶原等.而近年研究认为肝纤维化是可逆的病理过程,而肝硬化则不可逆转5.因而,研究 HF 的发生,发展,预防及治疗对降低肝硬化的发病率具有重要意义
16、.抗肝纤维化的治疗分为两个方面:一,是针对原发病的病因治疗;二,是针对抗纤维化本身的治疗,如抑制 HSC 的激活,抑制胶原的增生,促进胶原的降解等9.近些年来,国内学者报道以中药为主或中西药物联合应用治疗肝纤维化,动物实验和临床应用均显示出较好的效果_1 一.利加隆(LGI)的主要成分是水飞蓟宾 (SB),后者是水飞蓟素(SIL)3 种异构体中有效成分.有研究表明,本品的主要成分是水飞蓟秦,是由水飞蓟的种子提取出来的,是一种肝细胞膜稳定剂,可稳定细胞膜,保护肝细胞不受损害;可以捕捉氧自由基,减轻有毒物质引起的脂质过氧化反应;能够刺激肝细胞内蛋白质的生命合成,促进受损肝细胞复原;具有直接及间接的
17、抗纤维化作用 l1.肝纤维化的形成与发展是极其复杂的过程,中医药在干预肝纤维化方面已显示出较明显的优势.中药复方多成分,多环节,多层次,多靶点的药理学作用,可能是其优势的重要特点之一.研究中药复方抗肝纤维化的作用机理,深化对中药复方的认识,是促进中医药临床推广应用的重要基础.肝纤灵汤由黄芪,冬虫夏草,炙鳖甲,丹参,桃仁,土茯苓,郁金,虎杖,甘草等组成.据现代药理研究,黄芪可明显减少总胶原 RI,IIl,II 型胶原在大鼠肝脏的病理性沉积,对实验性肝纤维化具有明显的治疗作用.且随着疗程的延长作用有所增强.丹参能明显减少 CCL 诱发的肝纤维化大鼠肝内胶原,纤维粘连蛋白(FN)和层粘连素(LN)的
18、含量,明显抑制 I,II,IV 型胶原量的病理性增加,并相应的降低转化生长因子 P(TGF-P)RNA 的含量,抑制 HSC 转化为成纤维细胞的核分裂和增殖2. 上海中医学院肝硬化研究室以桃仁霜和桃仁56 云南中医中药杂志 2009 年第 3O 卷第 1O 期提取物对家兔实验性肝纤维化治疗后发现,兔纤维化程度显着减轻,沉积的纤维量减少,肝内胶原量降至接近正常值.因此对于 CCh 大鼠肝纤维化,桃仁提取物有着较好的抗肝纤维化作用.若与人工虫草菌丝合用,疗效更为明显.冬虫夏草系传统补益类中药,天然虫草及人工培养虫草在逆转 DNA 大鼠肝纤维化中作用突出2122. 全方共奏益气活血,软坚散结之功.对
19、肝纤维化有着较好防治作用.本实验采用四氯化碳(CCh)诱导大鼠肝损伤及肝纤维化模型,并用肝纤灵汤,利加隆及肝纤灵汤结合利加隆进行治疗.肝纤灵汤结合利加隆组肝脏炎症表现及肝纤维化程度明显改善.血清型前胶原肽,型胶原放免测定结果显示均较模型组明显降低,治疗效果依次为:联合治疗组单纯中医或西医组,Western-blot 测定 PIIIP 型胶原也显示同样效果.而肝功能的检测也显示了联合治疗组对肝功能指标的改善明显优于单纯单纯中医或西医组.表明肝纤灵汤结合利加隆组能有效地抑制大鼠肝内 PIIIP,IV 型胶原的累积,因而推测中西医结合可能通过抑制肝脏胶原合成而实现抗纤维化作用,也可通过保护肝功能,抗
20、炎,抗病毒,抑制免疫等环节起到抗纤维化的作用.中西医药物联合治疗肝纤维化方面的协同作用目前研究还处于初级阶段,其相互作用和临床疗效还有待进一步深入研究,为将来临床治疗肝纤维化提供丰富的理论依据.参考文献:1ScheuerPJ.Classificationofchronicviralhepatitis:aneedforreassessmentJ.JHepatol,1991,(13):372374.2SchppannStructureoftheextracellularmatrixinnormalandfibrotiliver:collagenandglycoproteinsJ.SeminLive
21、rDis,1990,(10):1 10.3PierceRA,GlaugMR,GrecoRS,MackenzieJW,BoydCD,DeaSB.IncreasedprocollagenmRNAlevelsincarbontetrachlorideinducedliverfibrosisinratsEJ.JBiolChem,1987,(262):16521658.4BenyonRC,ArthurMJ.ExtracellularmatrixdegradationandthroleofhepaticstellatecellsJ.SeminLiverDis,2001,(21):373384.5Benyo
22、nRC,IredaleJP.IsliverfibrosisreversibleGutJ,2000,(46):443446.6OkazakiI,WatanabeT,HozawaS,NiiokaM,AraiM,MaruyamaK.Reversibilityofhepaticfibrosis:fromthefirstreportofcolla-genaseinthelivertothepossibilityofgenetherapyforrecoveryJ.KeioJMed,2001,(5O):5865.7Garcia-BanuelosJ,Siller-LopezF,MirandaA,Aguilar
23、LK,AguilarCordovaE.ArmendarizBorundaJ.Cirrhoticratliverswithextensivefibrosiscanbesafelytransducedwithclinical-gradeadenoviralvectorsJ.Evidenceofcirrhosisreversion.GeneTher,2002,(9):127134.8BaiwY,TaoXX,FengLY.TheadvanceofliverfibrosisJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2000(8):12671268.91 贾继东 ,尹珊珊,肝纤维化的诊断和治疗
24、进展J.临床内科杂志,2002,19(4):244246.10KayanoK,SakaidaI,UchidaK.OkitaK.InhibitoryeffectsoftheherbalmedicineShosaikoto(TJ 一 9)oncellproliferationandprocollagengeneexpressionsinculturedrathepaticstellatecellsJ.JHepatol,1998,(29):642649.111YangH,ChenY,XuR,ShenW,ChenG.Clinicalobservationonthel0ngtermtherapeutic
25、effectsoftraditionalChinesemedicinefortreatmentofliverfibrosis.JTraditChinMed,2000,(2O):247250.12SunYF.TaoXX,JiangSLTreatmentofChinesemedicineinliverfibrosisJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2000,(8):686687.13YaoX,YaoXX,XiuHM,GaoJP,ZhangYZ.Blood-aetivatingandstasiseliminatingeffectsofconcentratedYigandecoc
26、tionofChineseherbonhepaticfibrosisinratsJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2002,(10):544548.14YangQ,YanYC,GaoYX.InhibitoryeffectofQuxianruanganCapsulaeonliverfibrosisinratsandchronichepatitisatientsJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2001.(9):12461249.15LiuYK,ShenW.EffectofCordycepssinensisonhepatocyticpro-liferatio
27、nofexperimentalhepaticfibrosisinratsJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2002,(1O):388391.16YaoYX,TangYw,YaoDM,XioHM.EffectofYiganDecoctionontheexpressionoftypeI,mcollagenproteinsinexperimen-talhepaticfibrosisinratsJ.ShijieHuarenXiaohuaZazhi,2001,(9):263267.17曾斌芳,李靖 ,郭峰,等.肝纤维化的中西医治疗进展J.新疆中医药,2006,24(4):8486.1
28、8肝纤维化中西医结合诊疗指南中国中西医结合学会肝病专业委员会J.中西医结合肝病杂志,2006,16(5):316320.191 刘永刚 ,厚昌,蒋毅萍,等.中草药抗肝纤维化的研究J.中药材,2001,24(3:212214).2O马学惠.丹参对实验性肝硬变细胞外基质影响的免疫组化观察J. 肝脏病杂志,1994:2(2):7981.21王要军,孙自勤 ,权启镇,等.冬虫夏草对大鼠实验性肝纤维化的防治作用及其机理研究J.中国中药杂志,1996,11(3):179.22刘平,王晓玲 ,刘成海,等.冬虫夏草和丹参对肝星状细胞活化型胶原及转化生长因子与蛋白表达的影响J.中华肝脏杂志,1999,(7)24.(收稿日期:20090504)
