1、弓形虫感染对大鼠移植心脏存活时间的影响中华器官移植杂志 2005 年 9 月第 26 卷第 9 期ChinjOrganTransplant,Sep2005,Vo1.26,No.9弓形虫感染对大鼠移植心脏存活时间的影响甄忠广明长生曾志贵孙仁虎叶笃筠【摘要 1 目的探讨受者弓形虫感染对同种心脏移植物存活时间的影响.方法通过腹腔注射的方法建立弓形虫感染的大鼠模型,分别于感染后 47d(急性感染组)或感染后2732d(慢性感染组)进行同种异体颈部心脏移植,并设注射生理盐水的对照组和同系移植对照组.术后不用免疫抑制剂,观察移植心脏的存活时间以及移植物的病理变化.结果同系对照组的移植物存活时间为(135.
2、330.4)d;慢性感染组移植心脏的存活时间为(73.649.3)d,明显长于生理盐水对照组和急性感染组(P().01),其移植心脏组织中的炎症细胞浸润也较对照组显着减轻 ,尤其是移植物存活时间超过 100d 者,无慢性移植物病变.结论受者的弓形虫感染能显着延长同种心脏移植物的存活时间,减轻移植物炎症反应.【关键词 1 心脏移植;弓形虫属;感染;移植物存活;大鼠ProlongationofratheartallograftsurvivalbToxoplasmaGondiiZHENZhong-guang,MlNGChangsheng,ZENGZhigui,eta1.InstituteofOrga
3、nTransplantation,TongJiHospital,Tor,fgJiMedicalCollege,HuazhonguniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,ChinaAbstractObjectiveToexploretheeffectsofToxoplasmaGondiiinfectiononheterotopiccar-diacallograftssurvivalinrats.MethodsThroughtheintraperitonealiniection,theratrecipientswereinfectedwith 丁 0
4、OplasmaGondiitachyzoites47days(acuteinfectiongroup)or2732days(chronicinfectiongroup)beforecervicalheterotopichearttransp1antationsweremade.Sodiumandisograftgroupsservedascontrols.Aftertheoperation,therecipientswerenotsubjecttoimmunosuppresants.Thesurviva1timeandpathologyofheartgraftswereobserved.Res
5、ultsInisograftandchronicinfeCtiongroupsthesurvivaltime(135.330.4dand73.649.3drespectively)wassignificantlylongerandinfihrationofinflammatorycellsIessthaninthecontroIgroups.NoobviousmyointimaIproliferationofarteriesandendomyocardia1fibrosiscouldbeseeninthosesurvivedmorethan100daysinisograftandchronic
6、infectiongroups.ConclusionInfectionwith 丁.GondiibeforeoperationcanprolongthesurvivaltimeofheartallograftsandsuppresstheinflammationingraftKeywordsHearttransplantation;Toxoplasma;Infection;Graftsurviva1;Rats;同种移植物急性排斥反应的病理形态学特征为多种炎症细胞浸润,而慢性排斥反应则表现为动脉内膜的增生,管腔狭窄,间质纤维化等慢性炎症改变.弓形虫感染后宿主产生的炎症抑制因子,能抑制急,慢性炎症
7、,并促进损伤组织的修复 l_1,这一作用有可能对移植物具保护作用.因此,我们观察感染了弓形虫的大鼠接受同种心脏移植后移植物的存活情况,现报告如下.材料与方法一,实验动物作者单位:430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院教育部/卫生部器官移植重点实验室甄忠广 (E-mail:zgzhenS07yahoo.COITcn),明长生,曾志贵,孙仁虎;华中科技大学同济医学院病理生理学系(叶笃筠 )选用清洁级雄性 Wistar 大鼠和 SD 大鼠进行心脏移植,动物体重为 180250g;弓形虫培养采用健康雄性昆明鼠,体重 2025g,均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心.二
8、,实验材料,弓形虫速殖子由华中科技大学同济医学院寄生虫教研室赠送.手术器材包括显微手术器械,无损伤针线(10 0),解剖显微镜(瑞士 Leica 产品)等.三,大鼠颈部心脏移植采用笔者改进的大鼠颈部心脏移植模型 l_6.供心无名动脉,肺动脉分别与受者的右颈总动脉,颈外静脉端侧吻合.血流开放后,供心充盈,血液循环良好.术后移植心脏有力搏动超过 3d 为手术成功标志.每日触诊移植物搏动,记录移植心脏存活时间史堡鲞宣整焦盘查生!旦苤鲞箜!塑及炎性肿胀情况.anTransplant,Sep2005,Vo1.26.No.9四,弓形虫培养弓形虫用 RH 强毒株保种液复苏,腹腔注射法传代 5 次,取发病小鼠
9、腹腔冲洗液,离心后计数弓形虫速殖子,以生理盐水稀释成 10“个/L,备用.五,实验分组实验共分 4 个组,A,B,C 组的供 ,受者分别为雄性 Wistar 大鼠和 SD 大鼠 ,D 组供,受者均为雄性SD 大鼠.A 组(n=14) 为对照组 ,受者术前 28d 腹腔注射生理盐水 1ml;B 组(n=14) 为急性感染组,受鼠术前 47d 腹腔注射弓形虫速殖子稀释液 1ml;C 组(n=21)为慢性感染组 ,受者术前 2732d腹腔注射弓形虫速殖子稀释液 1ml;D 组(=6)为同系移植组,处理同 A 组.六,病理观察术后 6d,各组取 3 只受者,切取移植心脏及其主动脉弓,无名动脉以及受者自
10、体的脑,肝,肾,心脏,制成石蜡切片,HE 染色,镜检,按 Stanford 标准_7对移植心脏的排斥反应进行分级.各组移植物停跳后,取移植心脏组织及其主动脉弓以及受者的脑组织,分别观察移植物的急,慢性排斥反应以及弓形虫繁殖情况.七,血清抗弓形虫抗体的测定各组随机选取受者 3 只,以酶联免疫吸附法(ELISA 法)测定血清抗弓形虫抗体.八,统计学处理实验数据以均数标准差表示,组间比较采用F 检验,P0.05 为差异有统计学意义 .结果一,移植物存活情况B 组和 C 组术前感染弓形虫后均不同程度发病,大部分于 3 周左右症状消失.4 个组移植物的存活时间分别为(7.51.1)d,(7.91.9)d
11、,(73.649.3)d,(135.330.4)d(表 1).A 组与 B 组间存活时间的差异无统计学意义(P0.05);与 A,B组相比,C 组和 D 组移植物的存活时间明显延长(P().()1),其中 C 组 5 只存活时间超过 1(】()d,D 组均超过 10()d.二,病理变化术后 6d,A 组和 B 组可见移植心肿胀明显,与周围粘连,心肌增厚,心腔狭窄或消失;C 组移植心脏的肿胀较轻,与周围组织粘连不明显,心腔狭窄较?525?轻;D 组移植心脏无明显肿胀,心腔正常.移植物排斥反应分级分别为:A 组(3.60.6)级,B 组 4 级,C组(2.3 0.6)级 ,D 组 0 级.慢性感染
12、组炎症细胞浸润及心肌细胞损伤均较对照组明显减轻.表 1 各组移植心脏的存活时间三,C 组 (慢性感染组)的慢性排斥反应表现C 组移植物存活时间在 55d 以上者,动脉内膜均未出现增生,仅有少量炎症细胞浸润;存活时间超过 100d 者,移植心脏的心肌无明显增生,纤维化及炎症细胞浸润.四,弓形虫检测术后检查受鼠,各脏器均未发现弓形虫速殖子及包囊,但抗弓形虫抗体(IgG,IgM)均呈强阳性.讨论器官移植后,受者须终身服用免疫抑制剂,而临床常用免疫抑制剂均为非特异性的,可增加感染及肿瘤的发生率,对脏器也有不同程度的毒副作用.目前,急性和慢性排斥反应,抗排斥药物的毒副作用等仍然是移植物功能丧失的重要原因
13、.因此,人们一直在寻找一种新途径,即在避免使用大剂量免疫抑制药物的同时,能使移植物长期存活.我们从慢性寄生虫感染时虫体能长期寄生宿主体内的现象得到启示,寄生虫刺激机体产生的免疫调节作用及炎症消退效应,可能对移植物起保护作用.因此,我们观察了弓形虫感染对大鼠移植心脏存活时间的影响.大鼠腹腔注射速殖子后出现急性感染,约 3 周后转入慢性期.B 组(急性感染组)移植心存活时间和移植心脏排斥反应病理分级与对照组的差异无统计学意义,提示在弓形虫感染的急性期并未产生对移植物的保护作用.C 组(慢性感染组)在弓形虫感染 30d 前后进行移植,移植物的存活时间较对照组显着延长,其中 5 只大鼠移植物的存活时间
14、超过100d,其移植心的炎症细胞浸润较少,心肌组织损伤明显较轻,移植心脏排斥反应病理分级以级为主,表明弓形虫感染的慢性期可通过减轻移植心急矍宣担鏊圭年第 2 鱼卷第 9 期 ChinJOrganTransplant,Sep201)5,Vo1.26,No.9性排斥反应以及排斥所致的炎症损伤,对移植物形成保护作用.随着移植物存活时间的延长,移植心局部炎症细胞浸润逐渐减少,存活 50d 以上者,移植心主动脉弓及心肌小动脉内膜未出现增生及纤维化等慢性排斥反应表现.弓形虫感染对移植物的保护作用机理尚不清楚,可能与弓形虫感染增强受者免疫调节功能有关.弓形虫抗原携有 15 一脂氧化酶活性片段,后者促进受者产
15、生的脂氧素(LXA4) 可诱导 1 类 T 辅助细胞(TH1)向 2 类(TH2)偏移.移植物急性排斥反应由移植物抗原激活的 Tn1 介导 l_8,目前,临床应用的免疫抑制剂如环孢素 A,雷帕霉素,抗 CD4 单克隆抗体,以及门静脉注射或口服特异性抗原等延长移植物存活时间的方法,均作用于 Tn1 介导的免疫反应的各个环节.T1 向 Tn2 偏移则有助于延长移植物存活时间 L9,TH2 细胞产生白细胞介素 4(IL-4)和 IL 一 10 等增强免疫细胞调节功能的细胞因子,抑制细胞毒性 T 淋巴细胞对移植物的杀伤作用,可延长移植物的存活时间.Liwski 等 1“j 报告,巴西圆线虫感染能显着延
16、长大鼠移植肾和小鼠移植心脏的存活时间,并在体外实验证实,巴西圆线虫感染能激活 TH2 淋巴细胞,IL 厂 4 和 IL-6 表达增强,抑制 CD8 细胞介导的细胞毒性 T 淋巴细胞活性,而不抑制淋巴细胞混合培养的淋巴细胞增殖反应.因此,巴西圆线虫感染是通过激活 Tn2 淋巴细胞,产生免疫调节效应,从而保护移植物免受排斥反应的攻击.本实验中,弓形虫急性感染对移植心脏无保护作用,可能因为 Tn1 类细胞介导的促炎症因子(如 IL-2,丫干扰素等)作用较强1.l】l1,移植心脏炎症损伤较重.与此相反,弓形虫慢性感染期,Tn2 淋巴细胞介导的免疫调节作用逐渐加强,因而对移植物产生保护效应,该保护作用可
17、能与 LXM,IL-10及其它炎症消退介质有关(如 LXA4 可防止慢性炎症导致的慢性增生和纤维化)|1“.随着存活时间的延长,移植物未出现血管病变等慢性排斥反应表现,这是否有助于慢性排斥反应的预防,尚有待进一步研究.本实验中的长期存活大鼠,均未检出弓形虫及其包囊,提示弓形虫感染后移植心脏存活时间的延长可能并不依赖弓形虫的持续感染,虫体排除后,移植物仍可长期有功能存活.大鼠感染弓形虫速殖子 101()个可导致宿主发病,但宿主多数能长期存活,当感染量超过 10个,发病症状明显,且病死率快速上升.本实验选择感染量 1()个 ,因所致症状明确,易于确诊,且移植物存活时间延长显着,若超过此量,多数受鼠
18、不能耐受感染和手术.参考文献1BannenbergGL,AlibertiJ,HongS,eta1.Exogenouspathogenandplant15-lipoxygenaseinitiateendogenouslipoxinA4biosynthesis.JExpMed,2004,199:515-523.2AlihertiJ,SerhanC,SherParasite-;mducedlipoxinA4isanendogenousregulatorofIL 一 12productionandimmunopathologyinToxoplasmaGondiiinfection.JExpMed,20
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20、llySB,eta1.Modificationofthetranscriptomicresponsetorenalischemia/reperfusioninurybylipoxinanalog.KidneyInt,2003,64:480492.6 甄忠广,明长生.大鼠颈部心脏移植模型的改进.中华器官移植杂志,2005,26:503504.7TheInternationalSocietyforHeartTransplantation.Aworkingformulationforthestandardizationofinthediagnosisofnomenclatureheartandlun
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